新一代测序技术新一代测序技术——454基因组测序技术——454基因组测序技术背景介绍DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程，它已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的。但在过去几年，大规模平行测序平台（massivelyparallelDNAsequencingplatform）已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。测序策略454基因组测序使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法（cyclic-arraysequencing），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。测序策略图a为高通量鸟枪Sanger测序法策略图b为鸟枪循环芯片测序法策略测序原理在体外构建好的两端带接头的单链DNA文库在一个油包水的乳液环境中进行PCR扩增，因为起始阶段模板浓度非常低，因此，大部分包还有磁珠的为乳液滴都只含有一种模板，经PCR扩增后，每个磁珠只连有一种模板的扩增产物，然后打破为乳液滴，收集磁珠，加入芯片中。测序原理经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被放置到芯片上的微孔中。随后使用焦磷酸法测序，每一轮反应都会掺入一个核苷酸，同时释放一个焦磷酸，然后焦磷酸和腺苷酰硫酸在磷酸化酶的催化下生成ATP，然后荧光素酶就可以在ATP参与下将荧光素转化为氧化荧光素，同时发出荧光被检测器检测到。工作流程文库制备乳液PCR焦磷酸测序加入含酶小微珠芯片制备工作流程一.样品输入并片段化大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。工作流程二.文库制备借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。工作流程三.一个DNA片段连接一个磁珠单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。工作流程四.乳液PCR扩增每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。工作流程五.测序携带DNA的捕获磁珠（20um）随后放入PTP板（PicoTiterPlate）的微孔（29um）中进行后继的测序反应。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号。由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。工作流程六.数据分析454测序系统可以在10小时的运行当中获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。并提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。454测序系统图示A为液体试剂供应装置B为反应池C为光线检测成像系统和计算机控制系统测序质量454测序技术的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差。因此，454测序平台的主要错误类型是插入-缺失。总结454测序...
