聚丙烯酰胺凝胶电泳技术SDSPAGEVIP免费

一、基本原理概述二、SDS的性质与作用三、PAGE胶的性质四、缓冲液系统五、基本步骤SDS-PAGE原理一、SDS-PAGE技术基本原理概述SDS：消除了蛋白质分子间的形状差异；掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电）电泳时蛋白质按分子量大小分离观看视频XYZ+SDSPAGESDS-PAGEXYZ-+-结果受分子量大小电荷形状的影响结果只与分子量大小有关-+PAGE和SDS-PAGE的比较二、十二烷基硫酸钠（SDS）的性质与作用结合情况蛋白质：SDS=1:1.4作用去蛋白质电荷；消除蛋白质空间结构SDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。三、聚丙烯酰胺凝胶性质•单体：丙烯酰胺（Acr）；•交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；•催化剂：过硫酸胺（AP）；•加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；•产物：三维网状结构凝胶AP提供聚合所必需的自由基，10%过硫酸铵必须现用现配；Acr和Bis且具有神经毒性,聚合后毒性降低。PAG聚合过程图两种胶：浓缩胶孔径大，胶浓度2-5%分离胶孔径小，胶浓度>5%缓冲体系：1、配胶缓冲液：浓缩胶Tris-HCl6.7分离胶Tris-HCl8.82、上样缓冲液：Tris-HCl(pH6.8),DTT,SDS,溴酚蓝,甘油3、电泳缓冲液：Tris-甘氨酸8.3四、缓冲液系统浓缩效应示意图弱酸性,甘氨酸解离少,CL离子高,两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其分子大小进行分离。五、基本步骤制备分离胶制备浓缩胶上样并电泳凝胶板剥离与染色脱色结果分析5ml分离胶3ml浓缩胶水1.6ml2.1ml30%丙烯酰胺2.0ml0.5ml分离胶缓冲液PH8.8（含SDS）1.3ml---浓缩胶缓冲液PH6.8（含SDS）---0.38ml过硫酸铵50ul30ulTEMED2ul3ul凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入。注胶过程要一次性完成,避免产生气泡。浓缩胶分离胶配方ddH2O隔绝空气灌制分离胶灌制浓缩胶插入梳子点样加入分离胶溶加入分离胶溶液液pH8.8pH8.8封水或饱和封水或饱和正丁醇溶液正丁醇溶液出现明显界面时，分离胶凝聚完成（３０min~１h）倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。分离胶分离胶pH8.8pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳加入电极缓冲加入电极缓冲液液pH8.3pH8.3浓缩胶浓缩胶pH6.8pH6.8通电通电分离胶分离胶pH8.8pH8.8加入样品加入样品上样及电泳开始电压恒定在开始电压恒定在80V80V，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为120V120V，溴，溴酚蓝距凝胶边缘约酚蓝距凝胶边缘约5mm5mm时，停止电泳。时，停止电泳。凝胶板剥离与染色电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.结果分析标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=µ°°×ÑùÆ·¾à¼ÓÑù¶ËǨÒƾàÀ루cm£©äå·ÓÀ¶Çø´øÖÐÐľà¼ÓÑù¶Ë¾àÀ루cm£©Ïà¶ÔǨÒÆÂÊ以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。