人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法VIP免费

抗体的生物学活性1）特异性结合抗原2）激活补体3）结合Fc受体4）穿过胎盘5）免疫调节SCIDTherecombination–activatinggenes(RAG-1/2)requiredforsynthesisofthefunctionalIgandTCRthatcharacterizematureBandTcells.多克隆抗体用抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），是由体内分别针对抗原物质上的多个抗原表位(frommultipleplasmacells)，分别诱导多个不同B细胞克隆发生应答后产生的多种抗体，因此叫多克隆抗体。通常是指由一株B淋巴细胞杂交瘤增殖扩增而成的单一细胞克隆所产生的一种高度均一、高度专一性的抗体。单克隆抗体Monoclonalantibody1975withatechniquedevisedbyKöhlerandMilstein(forwhichtheywereawardedaNobelPrize).Theydidthisbyliterallyfusingmyelomacellswithantibody-secretingcellsfromanimmunizedmouse.Thetechniqueiscalledsomaticcellhybridization.Theresultisahybridoma(NS-1).NS-1是穩定的小白鼠BALB/c癌細胞株，除了能在培養基中永續生長外尚有一重要特性，細胞缺乏兩種核酸代謝重要酵素TK,thymidinekinaseHGPRT,hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferasepurinesHATmediumbecauseitcontains:•hypoxanthine•aminopterin•thepyrimidinethymidineThelogic:•UnfusedmyelomacellscannotgrowbecausetheylackHGPRT.•Unfusednormalspleencellscannotgrowindefinitelybecauseoftheirlimitedlifespan.•HybridomacellsareabletogrowindefinitelybecausethespleencellpartnersuppliesHGPRTandthemyelomapartnerisimmortal.BcellmyelomafusionHATELISAELISA抗體生產：1)可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL左右；腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達數mg。2)把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每mL只得約數mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。3)得到穩定的抗體後，通常要再以ELISA方法檢定該抗體的subclass是屬於IgG,IgM或IgA等。免疫時間太短的，較可能取得IgM，但一般仍以IgG較多，注意IgG又可分成幾種sub-subclass。4)所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰•硫酸銨分劃：收集約40%飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。•離子交換法：用DEAE陰離子交換法，多用在純化IgG。•膠體過濾法：以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化IgM。•親和層析法：以ProteinA-吸著劑專一性地吸住抗體分子(IgG)。Toachievethisend,weraisedmonoclonalantibodiesagainsttheKcsAK+channelenlargecultureandselectedclonesonthebasisoftheirabilitytorecognizethetetramericbutnotthemonomericformofthechannel.抗体的检测1.ELISA用于检测针对可溶性抗原(蛋白质)和细胞表面抗原的mAb。2.FACS(流式细胞仪)用于检测细胞表面抗原的mAb。3.用westernblot检测单抗的特异性。杂交瘤细胞的克隆化克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释法和软琼脂平板法。单抗制备过程的影响因素A.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。B.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不...