PCRSSCP原理及应用VIP专享VIP免费

PCR-SSCP 原理及应用 随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是 PCR 技术问 世以后，各种与 PCR 相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR 产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonu clease cleav age，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Poly morPhism，RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用.1989 年问世的 PCR-SSCP(下文称 SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于 DNA 定量分析，监测PCR 诊断实验中的交*污 染情况，以及传染源的调查等.由于 SSCP 的突出的优点，近几年被大量地应用. 一、SSCP 的原理及特点 日本Orita 等研究发现，单链DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA 分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的 分 子 分 离开. 作 者称 该方 法 为 单链构 象多 态 性 (Single-Strand Conformation Poly morPhism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又 将SSCP用于检查PCR 扩增产物的基因突变，从而建立了 PCR-SSCP 技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶 DNA;②将特异的 PCR 扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA 分子;③将适量的单 链DNA 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DNA 片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由 于 SSCP 是依据点突变引起单链DNA 分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链DNA 分子立体构象的改变不起作...