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半定量 RT-PCR 方法一 反转录—第一链 cDNA 的合成 参照 Promega RT-PCR 试剂盒说明书进行。取 2 μg 植物 total RNA，与 Oligo（dT）引物以 0.5 ug primer/ug total RNA 的比例混合，体积不超过 11 μL，70℃ 5 min，冰上冷却。加入各种反转录试剂混合： 10× reverse transcript buffer 2.5 μL； RNase Inhibitor 0.5 μL； dNTP Mixture 2.0 μL； Reverse Transcriptase 1.0 μL； RNase free Water 补足 25 μL； 混匀后，42℃ 1 h；75℃ 10 min。 PCR 合成第二链 取第一链产物 0.5 μL 为模板，按常规 PCR 程序进行 PCR 扩增。以拟南芥Actin7 基因为反应的内标对照。 方法二 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩 cDNA） 第一步：1.0 μg 拟南芥总 RNA和 1.0 μL oligo(dT) 引物，用水稀释到总体积5.0 μL 的体系，70℃加热 5 min 后，迅速置冰上。 第二步：在反转录作用下由随机引物引导反转录成 cDNA 第一条链。反应体系如下： 表 1 RT-PCR 反应体系 Table 1 The reaction system of RT-PCR MgCl2（25mM） 5×Rxn Buffer dNTP Mixture（25mM） rRNasin Ribonuclease inhibitor Reverse Transcriptase 总 RNA 2.0 μL 4.0 μL 1.0 μL 0.5 μL 1.0 μL 1.0 μg RNAtal 25.0 μL 反转录反应先在25℃下进行5 min，然后在42 ℃条件下进行50 min。转录反应物在70℃加热15 min 后置于冰上，取反转录反应物的0.5 μL 为模板，用如下的特异引物进行PCR 反应。 1.3.4 目的基因的获得 1.3.4.1 PCR 扩增目的基因 PCR 反应体系 Table 2 The reaction system of PCR 10×PCR Buffer(含Mg2+) 10mM dNTP Mix 10μM Prime R 10μM Prime F cDNA E×Taq (5U/μL) ddH2O 2.5 μL 1.0 μL 1.0 μL 1.0 μL 0.5 μL 0.2 μL 18.8 μL Total 25.0 μL 按上表配制 PCR 反应液，反应条件如下：预变性 95℃ 5 min；变性 94℃ 50 sec，退火 49～58℃ 60 sec，延伸 72 ℃60～150 sec，32 个循环；总延伸 72℃ 10 min。 Real time PCR 方法 一，单链 cDNA 的合成 单链cDNA的合成采用SYBR ExScriptTM RT-PCR kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)试剂盒进行，具体操作如下： 1. 在冰上按如下表配制RT反应液： Reagent Volume（μL） 0.5 μg RN...