分子克隆技术(步骤很详细)VIP专享VIP免费

分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定 DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入 DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将 DNA 片段(或基因)与载体 DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为 DNA 和 cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以 mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的 DNA(cDNA)，再与载体 DNA 分子连接引入寄主细胞。每一 cDNA 反映一种 mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是： ①有些生物，如RNA 病毒没有 DNA，只能用 cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为 cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一 cDNA 克隆只含一个 mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1.方法： (1)DNA 片段的制备：常用以下方法获得 DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的 DNA 片段；②用物理方法(如超声波)取得 DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从 mRNA 反转录产生 cDNA。 (2)载体 DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为 1-200 千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型” ；二是“松驰型” 。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体 DNA：常用的 λ 噬菌体的 DNA 是双链，长约49kb，约含 50 个基因，其中 50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体 DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子...