分子生物学与细胞生物学实验基本技术2VIP免费

1 实验十九 SSCP 技术检测基因突变 一 、目的 学 习 分 析 基 因 突 变 的 SSCP 技 术 。 二、概述 单 链 DNA 片 段 呈 复 杂 的 空 间 折 叠 构 象 ，这 种 立 体 结 构 主 要 是 由 其 内 部 碱 基 配 对 等 分 子内 相 互 作 用 力 来 维 持 的 ， 当 有 一 个 碱 基 发 生 改 变 时 ， 会 或 多 或 少 地 影 响 其 空 间 构 象 ， 使 构象 发 生 改 变 ， 空 间 构 象 有 差 异 的 单 链 DNA 分 子 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 受 排 阻 大 小 不 同 .因 此 ，通 过 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (PAGE)， 可 以 非 常 敏 锐 地 将 构 象 上 有 差 异 的 分 子 分 离 开 .该方 法 称 为 单 链 构 象 多 态 性 (Single-Strand Conformation Polymorphism， SSCP)分 析 。将 SSCP 用 于 检 查 PCR 扩 增 产 物 的 基 因 突 变 ， 从 而 建 立 了 PCR-SSCP 技 术 ， 进 一 步 提 高 了 检 测 突 变 方 法 的 简 便 性 和 灵 敏 性 .。 三、材料 电 泳 仪 ， 垂 直 板 电 泳 槽 ， 移 液 器 ， 枪 头 ， 载 样 缓 冲 液 ， 凝 胶 图 象 分 析 仪 等 。 四、实验步骤 1、 通 过 PCR 方 法 扩 增 DNA 片 段 ， 从 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 中 回 收 及 纯 化 DNA 片 段 。 2、 制 备 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (PAG)： 1) 制 备 适 宜 浓 度 的 胶 液 ， 加 入 胶 模 的 两 块 玻 璃 板 之 间 。 2) 在 胶 凝 固 之 前 ， 将 梳 子 插 入 模 子 。 3) 室 温 放 置 1h 使 之 凝 固 .然 后 拔 掉 梳 子 ， 顶 部 加 入 1×TBE 封 闭 ， 备 用 。 3、 加 样 1) DNA 变 性 ： 将DNA 样 品 与 载 样 缓 冲 液 （ 含50% 去 离 子 甲 酰 胺 的pH8.0 20mmol/L Tris-HCL） 混 合 ， 在 90-95℃加 热 3-5 分 钟， 然 后 立 即置 于 冰 2 浴 中 。 使 双 链 DNA 片 段 变 性 成 为 单 链 DNA。 2) 每 孔 加 样 量 5-15ul。 4、 电 泳 在 10-15℃下电 泳 .开始在 20W 电 泳 ，待样...