分子生物学实验技术方法VIP免费

【实验技术方法】分子生物学技术(zt) 分子生物学技术 真核细胞 DNA 的制备与定量|质粒 DNA 的碱裂解法提取与纯化|λ噬菌体DNA 提取|DNA 分子的限制性内切酶消化|DNA 片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR 产物的克隆|DNA 序列测定|Southern 杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA 操作中的一般要求|RNA 的制备|mRNA 的分离与纯化|RT-PCR|Northern Blot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白 SDS 电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染 真核细胞 DNA 的制备与定量 制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在 DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素，以保证 DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组 DNA 有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在 EDTA 以及SDS 等试剂存在下用蛋白酶 K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的 DNA 不仅经酶切后可用于 Southern 分析，还可用于 PCR 的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的 DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制 DNase 对DNA 的降解；（2）尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏。 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶 K 至100mg/ml。 4．20% SDS 5．2mg/ml 蛋白酶 K 6．Tris 饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇 二、操作步骤 （一）材料处理 1．新鲜或冰冻组织处理： ⑴ 取组织块 0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 ⑵ 将匀浆液转移到 1.5ml 离心管中。 ⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶 K (2mg/ml) 25 ml，混匀。 ⑷ 60°C 水浴 1-3hr。 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS 洗涤一次。 ⑵ 离心 4000g× 5min，去除上清液。 ⑶ 加10 倍体积的裂解缓冲液。 ⑷ 50-55°C 水浴 1-2hr。 （二）DNA 提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀 3min。 2. 离心 5000g× 10min，取上层水相到另一 1.5ml 离...