华中科技大学 生命科学与技术学院 生物医学工程 分子生物学实验报告 - 1 - 2011/11/18 生命学院09 级分子生物学实验报告 目录： 实验一 质粒 DNA 的小量制备（P2-P4） 实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定（P4-P7） 实验三 感受态细胞的制备及转化（P7-P9） 实验一 质粒DNA 的小量制备 一、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA 的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 3. 制取质粒以备大肠杆菌的培养和电泳。 二、实验材料及试剂 材料：大肠杆菌E.co li，含pBR322 质粒。 试剂： 1. LB 培养基：10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH 至7.3 左右。如固体培养基则添加15g/L 琼脂。 2. 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T 缓冲液）：50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。 华中科技大学 生命科学与技术学院 生物医学工程 分子生物学实验报告 - 2 - 2011/11/18 3. 溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS 母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。 4. 溶液Ⅲ（pH4.8 乙酸钾溶液）：5mol/L 乙酸钾 60mL、冰乙酸 11.5mL、双蒸馏水 28.5mL。 5. 酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为 24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的 0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。 6. 无水乙醇 7. 70％乙醇 8. pH8.0 TE 缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA 酶20μg/mL。 仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP 管(1.5mL 微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。 三、实验步骤 从菌落中快速提取制备质粒 DNA 1．取 1.5mL(750uL 取两次)菌液置于 1.5mL Ep 管中，7500rpm 离心 1min。 2．弃上清，重复步骤 1，弃上清，加入150μL GET 缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀。 3．加入300μL新配制的 0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3 次，使之混匀。 4．加入225μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀。 5． 10000rpm 离心 5min，上清液吸至另一干净的 1.5mL Ep 中，如上清液浑浊则需重新离心一次。 6．于上清液中加等体积氯仿，振荡...
