基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤VIP免费

1 基因表达量实时荧光定量PCR 检测步骤 1 材料（试剂和耗材） 1.1 样本（小鼠组织）-2 个 1.2 引物（life technology 公司合成） 1.3 BestarTMqPCR RT Kit（德国DBI 货号：DBI-2220） 1.4 Bestar® SybrGreenqPCRmastermix（德国DBI 货号：DBI-2043） 1.5 96 孔板（美国life technology） 2 材料（仪器） 2.1 ABI7500 荧光定量PCR 仪（life technology 公司） 2.2 TGL-16M 低温冷冻离心机（湘仪） 2.3 SW-CJ-1D 单人净化工作台（泸净净化） 2.4 HR40-Ⅱ A2 生物安全柜（Haier） 3 实验步骤 3.1 RNA 的抽提 RNA 的提取按life technology 公司提供的Triozol RNA 提取试剂盒的使用说明进行。程序如下： （1）将组织在液氮中磨碎，每50-100mg 组织加入1ml TRIzol； （2）加入0.2mL 氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s（请勿涡漩激烈振荡），室温静置3min，12,000g，4℃离心 15min，置于冰上； （3）溶液分为三层，RNA 溶解在水相中，小心吸取 500μ l 水相至另一个新的RNase free 的EP 管中； （4）加入500μ l 异丙醇，-20 度放置1h，12,000g，4℃离心10min，离心后管底出现 RNA 沉淀，弃上清； 2 （5）加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g 离心5min，去上清； （6）超净工作台上吹干样品10min，加入适量DEPC 水溶解RNA。加入40μl DEPC水溶解沉淀。 3.2 RNA 质量检测 紫外分光光度计测定RNA 浓度： sample ID concentration(ng/μL) 260/280 a 998 1.87 b 1024 1.97 3.3 去基因组 DNA 和 cDNA 的合成 将RNA 加入到gDNA 吸附柱，室温10,000g 离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA 的RNA。 把RNA 在65°C 条件下热变性5 分钟后，立即置于冰上冷却。 逆转录反应： 5×RT Buffer 2μL RT Enzyme Mix 0.5μL Primer Mix 0.5μL RNA 6μL RNase-free Water 1μL Toal 10μL 反应条件： 37°C, 15min 98°C, 5min 4°C,hold 反应结束后，-20°C 保存。 3 3.4cDNA 的实时荧光定量 PCR 3.4.1 实验步骤 每个样本分别设置3 个目的基因和3 个内参基因的平行实验。PCR 反应体系为20μL，根据表1.配置。反应条件为： 95°C2min 95°C10s 60°C34s（采集荧光信号） 72°C 30s 循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。 表1 20μl荧光定量PCR 反应体系 试剂 体积（μL） 终浓度 灭菌蒸...