微生物基因组无痕敲除技术介绍有痕敲除&无痕敲除基因敲除是一种常见的生物工程技术，可用于微生物基因组改造。有痕敲除的含义是每次敲除基因后都会在基因组中引入一种筛选标记。首先，当进行持续敲除时，多个抗性标记在同一株菌体中堆叠，使得背面抗体标记的选择越来越困难。另首先，抗体基因的插入可能会影响上下游基因的体现。因此，无痕（markerless/scarless）敲除越来越受到追捧，成为人们研究的重点。无痕敲除技术1 同源重组同源重组技术涉及 RecA 和 Red 重组系统，Red 系统含有明显的优势，涉及同源臂较短，重组率较高等，被广泛用于大肠杆菌的基因组编辑。然后 Red 系统存在外源片段残留的状况，例如残留一种 FRT 重组酶作用位点。研究人员通过持续的研究，对该系统进行了持续的优化和改善，并开发出了无痕敲除技术，方便进行持续多个基因的敲除操作。下面我们将对这些优化方略进行解读。1.1 环状质粒型同源重组载体环状质粒载体是实现大肠杆菌基因敲除的典型方略，依靠的是 RecA 重组系统。RecA 系统重要涉及 RecA、RecBCD、RuvA、RuvB、RuvC 等。RecA 含有与重组有关的活性，RecBCD 可降解线性 DNA 片段，通过 Chi 序列识别靶位点，形成单链区域，然后再 RecFOR、RecQ、RuvABC、SSB 等蛋白共同作用下由 RecA 进行同源重组。应用这类载体进行的基因敲除可分为 2 种类型，一种是通过同源单交换的插入型敲除，另一种是通过同源双交换的置换型敲除，后者可实现目的基因无痕敲除，但是第二步同源交换的效率较低。1.2 线性双链 DNA 型同源重组载体该载体根据 Red 重组系统。线性载体直接运用 PCR 的办法获得带有与靶基因同源的DNA 片段和抗性基因，在 Red 重组系统的辅助下实现大肠杆菌的无痕敲除。相比于质粒型载体，该办法能够避免目的基因突变体（如基因点突变、基因缺失突变、基因插入突变）克隆和质粒载体的构建，简化了流程。但是该办法有一种缺点，即线性 DNA 容易被RecBCD 酶降解。但这个问题能够被克服，Red 重组系统设计时就已经包含了能克制RecBCD 对线性 DNA 降解的 Gam 蛋白。该载体同样合用于 RecA 重组系统。图 1. 应用线性双链 DNA 型同源重组载体的无痕敲除技术原理图（Fehér 等）下图是葛高顺等人改善的大肠杆菌无痕敲除方略，第一步是采用两次 PCR 扩增出与目的基因两端同源并包含核酸内切酶 I-SceI 序列的氯霉素抗性片段。然后诱导质粒pKD46 体现 Red 同...
