MTX压力与表达筛选VIP免费

MSX 加压筛选与 MTX 加压筛选 分子生物与细胞培养 蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力； 氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。 1. CHO 细胞表达体系 常用的CHO 细胞系有两种：CHO 和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO 表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到 1000L 以上；CHO 细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。 改造 CHO 细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将 bcl-2 基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制 Gln 或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向 CHO 细胞中导入 p21、p27 基因，可使细胞G1 期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。 2. 载体系统 借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A 信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。 2.1 启动子和增强子 启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR 和CMV 启动子在CHO 细胞中效果良好。有研究表明：在CHO 细胞中，CMV 启动子的转录活性分别是SV40 启动子和LTR 启动子的10 倍和30 倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如 T7 启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的...