王军鹏济源市疾病预防控制中心2020年3月30日知识点：分离纯化技术细菌分离、接种技术和培养法一、原理：自然界微生物是以混杂的状态存在的，分离和纯化的目的是从各种样品来源混杂的微生物群体中获得纯种微生物，既在一定的培养条件下培养、繁殖得到只有一种微生物的培养物，也称为纯培养物。分离纯化微生物的方法有很多种，但基本原理相似。一、原理：1、将待分离的样品进行一系列的稀释，使稀释样品中的微生物或孢子呈分散状态；2、然后在适宜的培养机和培养条件下长出单菌落，3、再将单菌落转移培养，重复此过程两、三次便可获得纯种微生物。二、方法分类：常用的分离纯化的方法有:1、稀释倒平板法，2、平板划线分离法，3、涂布平板法，4、亨盖特稀释滚管法，5、单细胞（单孢子）挑取法，6、利用选择培养基进行分离等。二、方法分类：1、大多数好氧且数量大的微生物可采用稀释倒平板法和平板划线分离法进行分离；2、热敏菌和严格好氧菌可采用涂布平板法；严格厌氧菌采用稀释滚管法；3、对于比较大而个体数少的单细胞和单孢子，可采用单细胞（单孢子）挑取法；4、对于那些生长慢、营养要求或生长条件特殊的微生物，则需利用选择培养基结合其他方法进行分离。三、接种：微生物的接种是将一种微生物转移到另一灭过菌的新培养基中，使其生长繁殖的过程。接种方法有：1、斜面接种，2、液体接种，3、平板接种，4、穿刺接种等。无论是从斜面到斜面，或到液体，或到平板，或相反的过程，接种的核心问题在于接种过程中，必须采用严格的无菌操作，以确保纯种不被杂菌污染。四、稀释平板分离培养技术稀释平板分离法首先把微生物悬液作一系列的稀释液（如1:10、1:100、1:1000），取1:1000稀释液1ml置于灭菌的平皿中，然后倾注熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基，摇匀后待琼脂凝固，制成含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现单个菌落。五、涂布分离培养技术1.稀释涂布平板法（1）定义及特点将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数。例如：测定纯净水中大肠杆菌的含量。五、涂布分离培养技术（2）操作方法用移液管或移液枪分别取适合稀释度液（一般取3个梯度）1mL于已经倾倒且凝固好的培养皿中，用无菌涂布棒将稀释液充分涂开，待干。每个稀释梯度一般2~3个平行。1.目的了解平板划线法分离菌种的基本原理；掌握平板划线法分离菌种的基本操作；学习无菌操作技术。2.原理平板划线分离法，是指把杂菌样品通过在平板表面划线、稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。六、平板划线分离通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜。具体的划线形式有多种，常用方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。3.材料和器皿1菌种大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的混合培养斜面菌种。2培养基伊红美蓝琼脂培养基。3器皿无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。4.方法步骤1融化培养基将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。2倒平板待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板（每皿约倒15ml），平置，待凝。操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着...
