2025年重组质粒的构建与转化VIP免费

实验目的实验目的1.学习在实现 DNA 体外重组过程中，对的选择适宜的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的 DNA 进行切割，产生利于连接的适宜末端。2.学习设计构建重组 DNA 分子的基本办法，掌握载体和外源目的 DNA 酶切的操作。3.学习运用 T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的 DNA 片段连接起来，构建体外 DNA 分子的技术，理解并掌握几个惯用的连接方式。4.掌握运用 Cacl2 制备感受态细胞的办法。5.学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和办法。6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及 α 互补筛选法的原理及办法。7.学习并掌握使用 Omaga 试剂盒抽提质粒的办法及进一步拟定重组质粒中含有外源目的 DNA 片段。实验原理：实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反映体外构建重组 DNA 分子，首先要理解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体 DNA 时不能得到完整的目的基因。另首先要选择含有对应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。惯用的酶切办法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的 DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相似的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶解决载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的 DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简朴易行，但是后期筛选工作比较复杂。多个限制性内切酶都有其最佳反映条件，最重要的因素是反映温度和缓冲液的构成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度规定一致，原则上能够将这两种酶同时加入一种反映体系中同时酶切；如果不一致，则酶切反映最佳分步进行，惯用的酶切次序是 ：先低盐后高盐，先低温后高温。酶切与连接是两个亲密有关的环节，要达成高效率的连接，必须酶切完全，酶切的 DNA 数量要适宜。另外，酶切反映的规模也取决于需要酶切的 DNA 的量，以及对应的所需酶的量。普通的，酶切 0.2~1.0µg 的 DNA 分子时，反映体积约为 15~20µg，DNA 的量越大，反映体积可按比例适宜放大。酶的用量参考原则：一种原则单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解 1µg 的 pBR322 DNA 分子。如果酶活力低，能够适宜增加酶的用量，但是最高不能...