实验四PCR及电泳技术VIP免费

1.PCR的基本原理•PCR基本原理类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。•PCR的基本步聚1、变性(Denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火(Annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加热94℃引物酶②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’PCRCycle-Step3-At72℃TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2-4min，2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5’3’3’TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR仪PCR仪PCR仪11、、PCRPCR反应成分反应成分11）模板）模板单、双链单、双链DNADNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。一般一般100ngDNA100ngDNA模板模板/100/100ll。模板浓度过高会导致反应的非。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。PCRPCR反应体系反应体系模板引物TaqDNA聚合酶4种dNTP混合物Mg2+10×缓冲液22）引物）引物（（11）浓度）浓度0.1-0.50.1-0.5MM浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。•引物是PCR特异性反应的关键；•PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；•人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。33））TaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶•一般一般0.5-2.5U/500.5-2.5U/50ll；；•酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。44））dNTPdNTP((dATP、dCTP、dGTP、dTTP4）•dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度;;•四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等;;•PCR常用的浓度为50-200μM，不能低于1...