最新北大医学部复习资料精品CRISPR-cas9基因敲除原理及其应用VIP专享VIP免费

PKUSHC of Pharmacy现代生物技术理论与应用课程1 / 2By 秋和 Sharemy CRISPR-cas9 基因敲除原理及其应用什么是 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9基因编辑技术？其原理和技术要点是什么？与RNAi 的区别在于何处？举一个应用的例子？答：定义： CRISPR/Cas9 是最新出现的一种由人工构建RNA 指导 Cas9 核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。原理：在 CRISPR/Cas9 系统中，CRISPR 转录后形成crRNA ，crRNA 通过碱基配对与tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA 。而通过人工设计这两种RNA ，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ）， Cas9 首先与 sgRNA 结合成复合物，然后通过PAM 序列结合并侵入DNA ，形成 RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA 双链进行切割，使DNA 双链断裂。由于 PAM 序列结构简单（5’-NGG- 3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。技术要点：1. 从已知序列中通过PAM 定位寻找合适的靶点并合成gRNA ；2. 构建 gRNA 与 Cas9 重组质粒；3. 对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算；4. 挑选活性较高的敲除质粒导入细胞或体内进行基因组定点编辑操作；5. 利用测序、 RFLP 等方法检测基因组定点修饰结果。区别： CRISPR/Cas9 与 RNAi 的区别如下表：CRISPR/Cas9 RNAi 靶点 /目标1.DNA( 调控转录 ) 2.阻止转录起始或转录延伸1.RNA( 调控翻译 ) 2.RNA 降解3.定位于细胞质PKUSHC of Pharmacy现代生物技术理论与应用课程2 / 2By 秋和 Sharemy 3.编码基因和非编码基因均可4.定位于细胞核设计 /构建1.简单灵活2.可设计算法3.PAM 限制了其目标序列1.简单灵活2.可设计算法敲除效率1.易变2.脱靶效应 (可能较少 ) 1.易变2.脱靶效应应用： Rudolf Jaenisch 研究组将 Cas9 与 Te1 和 Tet2 特异的 sgRNA 共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES 细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。