荧光荧光PCRPCR？？荧光荧光PCRPCR？？•扩增产物荧光指示扩增产物荧光指示•动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化荧光物质荧光物质光能光能热能热能转移给临近的分子转移给临近的分子荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量后通常以三种方式释放出能量：1)光能许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值大于吸收峰。2)热能某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中，如Dabcyl。3)转移给临近的分子当临近的分子满足发生能量转移的要求时，能量从荧光基团传递到临近的分子。荧光标记信号的产生荧光标记基团在某波长的激发光刺荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，激下，产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光FRETFRET？？当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),(FRET),实际相实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。TaqmanTaqman？？TaqmanTaqman？？•特异性荧光双标记探针•Taq酶5’→3’外切酶活性•特异性荧光双标记探针•Taq酶5’→3’外切酶活性MolecularbeaconMolecularbeacon？？MolecularbeaconMolecularbeacon？？荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针变性变性退火退火延伸延伸CCTT值—样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数值—样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数（（cyclethresholdvalue)cyclethresholdvalue)•荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。定量PCR的数学原理斜率与扩增效率对数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较荧光荧光PCRPCR重现性重现性标准曲线→定量标准曲线→定量荧光双检多检检测试剂荧光双检多检检测试剂荧光双检多检检测试剂荧光双检多检检测试剂•原理针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶DNA，并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。•特点•一次性处理样品•一次性反应•一次性给出2种或2种以上病原体检测结果•两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰竞争性荧光内标(IC)定量PCR技术竞争性荧光内标(IC)定量PCR技术竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)(IC)竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)(IC)•什么是什么是IC?IC?Internalcontrol简称IC，通常是指与靶序列十分相似的一段DNA序列，两者在相同的条件下可被同一对引物扩增；区别在于两者的探针结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。•ICIC的作用的作用监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。内标工作原理图内标工作原理图内标工作原理图内标工作原理图荧光荧光PCRPCR特点特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过程，无需后处理采用dUTP—UNG酶的防污染系统，有效降低污染机会即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果
