原位杂交原理剖析VIP免费

原位杂交原理原位杂交技术是分子生物学和组织化学成功结合的产物。是以特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行原位检测的方法（insituhybridization）。基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究中，对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律、肿瘤发生机制及病原微生物的检测，有广泛的应用前景。如：（1）用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位；（2）与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平；（3）用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以确定有无该病原体的感染等。优点（1）能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；（2）由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。分类根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同可分为DNA---DNA杂交RNA---DNA杂交RNA---RNA杂交试剂TNE:50mmol/LTris-HCl,pH7.4,10mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA20×SSC:3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/LNaOH调)2×SSC:17.53gNaCl，8.82g柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/LNaOH调)，定容至1L杂交液:4×SSC,50%甲酰胺，1×Denhardt’s，5%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml鲑精DNABufferI:0.1mol/LTris-HCl,pH7.5,0.15mol/LNaClBufferII:0.5%Blockingagent,BufferIBufferIII:0.1mol/LTris-HCl,pH9.5,0.1mol/LNaCl,0.05mol/LMgCl2BufferIV:10mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA显色液：4.5μlNBT+3.5μlX-phosphate+1mlBufferIII方法1.取材2.固定3.脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）4.切片5.杂交6.冲洗与显色7.终止显色与复染8.封片9.观察与拍照固定现场取濒死斑节对虾，于第2、3腹节间和头胸部注射Davidson’sAFA固定液全身固定，切取头胸部，从额剑将头胸部分成2部分，再置Davidson’sAFA固定液中固定24h，转入70%乙醇中保存。组织块(V)：固定液(V)=1：30Davidson’sAFA固定液配方（1升）：95％乙醇330ml福尔马林（37％～39％甲醛水溶液）220ml冰醋酸115mlH2O335ml混匀后封口，室温放置。脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）70%乙醇1h×2可停留80%乙醇1h×2可停留95%乙醇1h×2无水乙醇45min×21/2无水乙醇+1/2二甲苯20min二甲苯5min×21/2二甲苯+1/2石蜡30min60℃烘箱石蜡I45min～1h60℃烘箱石蜡II45min～1h60℃烘箱石蜡III45min～1h60℃烘箱石蜡包埋切片①载玻片和盖玻片的准备：3%HCl+95%乙醇泡30min以上，擦干备用。硅化载玻片：2%APES于丙酮中2min丙酮1mindH2O1min37℃烘干备用②切4μm厚，42℃展片。杂交I①烘片：6045min℃②脱蜡与水化：二甲苯10min×21/2无水乙醇+1/2二甲苯5min无水乙醇2～3min×295%乙醇2～3min×280%乙醇2～3min70%乙醇2～3min可停留50%乙醇2～3min可停留dH2O2～3min杂交II③消化：1×TNE5minPrK10μg/ml200μl/片，37℃，10min(10mg/ml母液用1×TNE稀释1000倍)④后固定：0.4%甲醛5min⑤杂交：2×SSC5min探针先于100℃变性5～10min，立即置冰上5min，甩。含10～25ng/100μl探针的杂交液100μl/片，并用盖玻片和矿物油封片，95℃，6min立即置冰上5min42℃杂交过夜冲洗与显色2×SSC375min×2℃1×SSC375min×2℃0.5×SSC375min×2℃0.1×SSC375min×2℃1×BufferI室温5minBufferII200μl/片室温5minAp(用BufferII稀释5000倍）100μl/片3730℃～45minBffeurI室温5min×2BufferIII室温5minNBT/BCIP(200μl溶于10mlBufferIII中)，200μl/片，避光勿动室温2h～过夜终止显色、复染与封片BufferIV停止显色室温15mindH2O2～3min中性红或Bismark棕Y复染1mindH2O洗3次封片、观察及拍照...