枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化VIP免费

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化采用改进的Spizizen 法进行，详述如下：A，试剂SPI-A Salts Solution ：0.4% 硫酸铵（ NH 4） 2SO4 132 2.8% K 2HPO 4·3H2O 228 1.2% KH 2PO4136 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate （柠檬酸三钠 -2-水）即二水合柠檬酸三钠210 121°20min 灭菌（每次用完要灭菌）SPI-B Salts Solution ：0.04%MgSO 4*7H2O 120 121°20min 灭菌（每次用完要灭菌）100×CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物）10% Yeast Extract 121°20min 灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）100×EGTA solution ：10mMol/L EGTA (NaOH调 pH 至 8.0) SPI Medium （20ml ）SPII Medium （6 ml ）9.8 ml SPI-A Salts Solution 5.88ml SPI Medium 9.8 ml SPI-B Salts Solution 60ul 50mM CaCl2 200ul 50% Glucose （ 0.1g）60ul 250mM MgCl2 200ul 100× CAYE solution 注： SPI、SPII 量比较少，容易干，确保大肠转化成功再配。B 感受态细胞的制备和转化1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB 液体摇瓶， 37° 摇床过夜2. 第二天早上取100ul 过夜培养的菌液， 接种于 50ml 离心管配好的5ml SPI Medium 中，37°摇床培养， 3h 后开始测 OD600 （一般不用测） ，当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到 2ml SPII Medium 中， 37° 100rpm 1.5h 3. 加 20ul100 ×EGTA 溶液， 37° 100rpm 10min ， 用 1.5ml 离心管分装成500ul 每管4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul ，轻轻混匀与37° 100rpm 30min 5. 将离心管转移到250rpm，37° ， 1.5h 6. 以 4000rpm 离心收集菌体。弃部分上清，留100ul 重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37° 过夜。离心管选用10ml 或者 50ml 带螺帽的底部尖的离心管。感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用大肠的抗性（ Amp ），枯草的（ Kan）枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化（1）挑取枯草芽孢杆菌168 单菌落与 3mL 液体 LB 培养基中， 37℃过夜培养（2）取 100ul 过夜培养物，接种于5 ml SPI 培养基中， 37℃， 200rpm 震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul 接种于 2ml 的 spII 培养基，37℃， 100rpm 震荡培养，培养1.5h （3）加入 20ul100 ×EGTA 溶液， 37℃， 100r/min 震荡 10min（分 500ul/管）...