枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化采用改进的Spizizen 法进行,详述如下:A,试剂SPI-A Salts Solution :0.4% 硫酸铵( NH 4) 2SO4 132 2.8% K 2HPO 4·3H2O 228 1.2% KH 2PO4136 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate (柠檬酸三钠 -2-水)即二水合柠檬酸三钠210 121°20min 灭菌(每次用完要灭菌)SPI-B Salts Solution :0.04%MgSO 4*7H2O 120 121°20min 灭菌(每次用完要灭菌)100×CAYE solution : 2% Casamino acid(酪蛋白水解物)10% Yeast Extract 121°20min 灭菌(灭菌一次,每次在超净台取样)100×EGTA solution :10mMol/L EGTA (NaOH调 pH 至 8.0) SPI Medium (20ml )SPII Medium (6 ml )9.8 ml SPI-A Salts Solution 5.88ml SPI Medium 9.8 ml SPI-B Salts Solution 60ul 50mM CaCl2 200ul 50% Glucose ( 0.1g)60ul 250mM MgCl2 200ul 100× CAYE solution 注: SPI、SPII 量比较少,容易干,确保大肠转化成功再配。B 感受态细胞的制备和转化1.前一天晚上挑取宿主菌(单菌落)接种于一支5mlLB 液体摇瓶, 37° 摇床过夜2. 第二天早上取100ul 过夜培养的菌液, 接种于 50ml 离心管配好的5ml SPI Medium 中,37°摇床培养, 3h 后开始测 OD600 (一般不用测) ,当培养物声场到对数末期时,快速取200ul接种到 2ml SPII Medium 中, 37° 100rpm 1.5h 3. 加 20ul100 ×EGTA 溶液, 37° 100rpm 10min , 用 1.5ml 离心管分装成500ul 每管4. 向管中加入适当的质粒,5-10ul ,轻轻混匀与37° 100rpm 30min 5. 将离心管转移到250rpm,37° , 1.5h 6. 以 4000rpm 离心收集菌体。弃部分上清,留100ul 重悬菌体,涂布于响应的抗性平板。37° 过夜。离心管选用10ml 或者 50ml 带螺帽的底部尖的离心管。感受态细胞不能保存,因此,需要现做现用大肠的抗性( Amp ),枯草的( Kan)枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化(1)挑取枯草芽孢杆菌168 单菌落与 3mL 液体 LB 培养基中, 37℃过夜培养(2)取 100ul 过夜培养物,接种于5 ml SPI 培养基中, 37℃, 200rpm 震荡培养,当培养至对数期末期,快速取200ul 接种于 2ml 的 spII 培养基,37℃, 100rpm 震荡培养,培养1.5h (3)加入 20ul100 ×EGTA 溶液, 37℃, 100r/min 震荡 10min(分 500ul/管)...