当前文档修改密码： 8362839实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标： 了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点： 掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。三．难点 ：分离和培养原生质体的技术。四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。五．教学内容 :实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”, 是开展基础研究的理想材料。其中, 酶解法分离原生质体是一个常用的技术, 其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成, 因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分 , 除 去细胞壁 , 即可得到原生质体。 由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜 , 必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次 , 还应当考虑取材、 酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、 酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光 , 无极性 , 可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后, 由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜 , 因此有活力的细胞能产生荧光, 无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。从理论上讲， 植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、 茎尖、 嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。实验方法1．把叶片 ( 或花期短的花瓣) 洗净，把表面水吸干。 （2 人一组）2．撕去叶片背面的表皮，用2ml 离心管的盖打下1 圆片。圆片扣压于 0.5ml酶液面上。 让去除下表皮的一面...
