免疫细胞研究w estern blot Western Blot 常见问题及处理总结 阿 木 1、w estern blot 的优点 答： 灵敏，可达 ng 级，用 Ecl 显色法理论上可达 pg 级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？ 答： 原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入 PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答： a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长， b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做 WB？ 答：可以选择 0.2μml 的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？ 答：你的一抗浓度较高，二抗上 HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的 HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM 底物中 H2O2，不稳定，失活；c) ECL 底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。 9、我在显影液中显影 1 分钟和 5 分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。 10、DAB 好还是 ECM 好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是 HRP 最敏感的底物；ECM 结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测 pg 级抗原。要看你实验的情况。 11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？ 答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等 12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker...
