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Imagej对SDS-PAGE灰度分析定量蛋白浓度朱伟伟20180319每个泳道对应的数值为点样体积(μl),制备所有样品的时候蛋白溶液和2*loadingbuffer的体积比均为1:1SDS-PAGE图像,可以用相机或光密度扫描仪成像,作为标准样品的蛋白最好和待测蛋白的条带大小一致,用Bradford的方法测得标样的浓度,然后把标样的浓度调成300μg/ml。注意事项:一般用SDS-PAGE灰度分析的方法检测蛋白浓度,其上样量不宜过大,条带太黑容易过曝,导致定量结果不准确,检测结果会小于实际的蛋白浓度。1、打开imagej把SDS-PAGE图片拖到红色箭头所指区域。2、单击image—Type—8-bit转换成灰度图像。3、单击process—subtractbackground会出现左图的界面,勾选lightbackground和preview,选择合适的像素值,在此一30.0pixels为例,单击OK。4、方框工具选择并画出第一条永道,单击analyze—gels—selectfirstlane也可以用快捷键(Ctrl+1)4、方框工具选择并画出第一条永道。单击analyze—gels—selectfirstlane也可以用快捷键(Ctrl+1),会出现左图界面,点击OK,并在图上画出第一条条带。5、单击analyze—setmeasurements出现下图界面,勾选Area和meangrayvalue单击OK。7、选好条带以后按住Ctrl+m出现一个文本,如上图所示;然后把鼠标移到黄色方框的中心,按住鼠标,把方框拖到下一个条带,然后按Ctrl+m,文本中出现第二条带的面积和平均灰度值;以此类推。8、新建一个Excel,把文本框内的数据复制到表格,计算绝对灰度=255-灰度平均值,同时标出点样体积。理论上,标样的绝对灰度值的比值和点样体积比值是相等的,我们可以选择绝对灰度比值和体积比最接近的一对数据,如红色框内数据。

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