慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6h 更换为完全培养基，培养 48 和 72h 后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2,pMD2G,PHBLVTM 系列质粒。1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM（含 10%FBS）。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。3、菌株大肠杆菌菌株 DH5a。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、包装细胞 293T 细胞的培养（一）293T 细胞的冻存随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液，加入 PBS 洗去残留的培养基；2、加入％的胰酶，消化 1〜2min 后,镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL37°C 预热的 10%DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6〜8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于 eppendorf 管中，加入 450ul10%DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。4、细胞离心，lOOOrpm,5min。去掉上清。5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞,密度为 3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80°C 超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）293T 细胞的传代当细胞生长到汇合率达到 80%〜90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到 10cm 培养...
