下载后可任意编辑Q-PCR 实验流程一、 ① 实验前准备, 每天早上到实验室后, 先把超净工作台的紫外灯打开 15-20 分钟。②超净台前做实验, 需佩戴洁净的橡胶手套/一次性薄膜手套, RNA 抽提需带口罩。③取 EP 管/枪头时需用镊子, 不能够用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/枪头后, 袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外, 实验操作过程中不得带出超净台, 移液器在一天工作结束后调至最大量程, 并用 75%乙醇清洁移液器, 枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时, 没有带口罩不要在超净台前讲话。二、 总 RNA 抽提1) 细胞培育皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后, 用 1ml 枪将PBS 吸洁净, 加入 1ml Trizol ( Invitrogen) 溶液, 吹打混匀, 并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解, 室温静置 5min; 组 织 样 品 用 液 氮 充 分 研 磨 , 加 入 1ml Trizol ( Invitrogen) 溶液, 混匀, 室温放置 5min 使其充分裂解; ( 管盖与管壁都需标记样品名称 ) 2） 加入 200μl 氯仿, 剧烈振荡混匀 30s, 使水相和有机相充分接触, 室温静置 3-5min; ( 离心时离心管按顺序排 放 , 离心完毕 , 离心管的顺序也按顺序排好 , 与第一步 的顺序一致 ) 3) 4℃下, 14,000g 离心 15min, 可见分为三层, RNA 在上层水相, 移至另一个新的 RNase free EP 管; ( 用 20- 200ul 的枪吸取上清 , 吸上清时 , 枪头应沿着液面上层吸取 上清 , 枪头不可碰到、 吸到中间层 ) 下载后可任意编辑4） 沉淀 RNA: 加入等体积异丙醇, 轻柔地充分混匀( 颠倒6-8 次) ( 不应用振荡器混匀 ) , 室温静置 10min; 5）4℃下, 14,000g 离心 10min, 收集 RNA 沉淀( 如离心后仍不见 EP 管底部有沉淀 , 应将 EP 管放置在 -80 度冰箱过夜 , 继续在 4 ℃ 下 , 1 4 ,000g 离心 10min, 收集 RNA 沉淀 ) , 去上清; 6）用 75％乙醇洗涤两次( 12,000g 离心 5min) ( 加入乙醇 后只需轻轻颠倒 EP 管即可 , 不用振荡器震荡或枪头吸打沉 淀 ) , 超净台风干; 沉淀不能过干或过湿, 过干则不易溶解, 过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量 DEPC 水( 至少 15ul) 溶解沉淀。三、 去基因组 使用 RNase-free 的 DNase ( ІPromega) , 按以下体系配置反应液, 37℃消化 30min, 65℃灭活 10min。RNA...
