大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株（如 XL1-Blue, DH5α）置于 LB 或其他营养丰富的培养基上，在 37°C 下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约 1.5 升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移 0.2-1ml 过夜培养物至装有 500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的 1-2 升挡板摇瓶中 5. 37°C 下剧烈振荡培养 2-6 小时 6. 定时监控 O.D.600 值（培养 1 小时后每半小时测定一次） 7. 当 O.D.600 值达到 0.5-1.0 时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少 15 分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在 4°C 5000g 下离心 15 分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在 4°C 的 10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的 2/3 体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用 20ml 灭菌的、冰冷后的 10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用 10%甘油重悬浮细胞至最终体积为 2-3ml 16. 将细胞按 150μl等份装入微量离心管，于-80°C 保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约 5 分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约 5 分钟 3. 转移 DNA/细胞混合物至冷却后的 2mm 电穿孔容器（无泡）中 4. 加载 P1000，准备好 300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在 3 以上） 6. 立即添加300μl 的 LB 或 2xYT 至电穿孔容器中 7. 37°C 下培养细胞 40 分钟至 1 小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素 1、 感受态细胞的概念 重组 DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 ...
