大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化

广东石油化工学院 实 验 报 告 生物技术系 专 业 生物技术 班 别 学号 姓 名 同组人 实验课程 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化 实验日期 2011-6-13至 2011-6-21 成 绩 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化 1 一、实验目的： 1.学习并掌握大蒜 SOD 提取与纯化的方法及原理。 2.学习并掌握 DEAE-纤维素离子交换层析分离纯化蛋白质的操作方法。 3.学习并掌握 SDS-PAGE 法测定蛋白质分子量的方法。 4.学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定 SOD 酶活的方法。 5.熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。 二、实验原理： 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应，使 O2-转化为 H2O2 和 O2。因此，SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。 SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为 Fe-SOD、Mn-SOD和 Cu/Zn-SOD 3种。Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的 SOD，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为 32KD，一般由两个亚基组成。SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但 Cu/Zn-SOD对氰化物及过氧化氢均敏感。SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。Cu/Zn-SOD由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为 258nm，由于含铜，所以在可见光 680nm处有最大吸收。 国内测定 SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O2-）。中间产物在 325 nm 和 420nm 波长处均有强烈的光吸收。邻苯三酚的自氧化速率与 O2-的浓度有关。当有 SOD存在时，由于它可催化超氧负离子 (O2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：222222OHOHO，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。因此，可通过监测 SOD 对这个反应的抑制程度间接测定 SOD 活力。大蒜中的 SOD正属于Cu/Zn-SOD。 三、实验材料 实验材料：大蒜 四、实验操作步骤 1 、粗酶液制备与沉淀分离 [试剂和器材]： (1) 材料 市售新鲜大蒜. (2) 仪器 恒温水浴 、离心机、 布氏漏斗、抽滤瓶 烧杯、量筒、搅棒、 透析袋 、 2 搅拌机...