细胞渗透性实验步骤细胞渗透性实验实验材料:1. Caco-2 细胞;2. 培 养基 DMEM(高糖,含Gln ,无丙酮酸,Gibco/Invitrogen, cat. no. 41965-039);a) 完 全 培 养 基DMEM+10% FCS + 1% NEAA (Gibco/Invitrogen, cat. no. 11140-035);b) DMEM-双抗培养基 DMEM+10% FCS+1% NEAA+1%双 抗( Gibco/Invitrogen, cat. no. 15140-122);3. 0.25%胰酶+EDTA;4. HBSS(Hank’s balanced salt solution)(cat. no. H1387)配制 1L,加入 HEPES(终浓度 25mM)和 NaHCO3(终浓度 0.35g/L ), 调整 PH=7.4并过滤除菌(如果要模拟小肠酸环境或研究质子依赖的转运机制,则以PH=6.5 的甲磺酸代替HEPES,终浓度 10mM,调整 PH=6.5);5. DMSO(在药物不溶于 HBSS时使用,99.5%纯度,作为共溶剂,使用时DMSO终浓度不能超过1%);6. [ 14C]mannitol( supplied by NEN Life Science Products , 具 有 放 射 性 ) 或 用fluorescent compound lucifer yellow(需要的药物浓度高于 [14C]mannitol)7. 分析药物含量的溶剂,如HPLC溶剂;8. BSA,如检测脂溶性化合物则需要BSA;9. 配制药物,用上述HBSS溶液按需要的浓度溶解药物,使用前检查配制后的溶液PH值,如PH改变,则调整相应的至7.4 或 6.5 。要点:1. 有些药物可能会破坏Caco-2 细胞层的完整性,造成通透性升高,一般以[14C]mannitol作为 marker,通常完整的 Caco-2 细胞层通透性为 1.2 ± 0.5 ×10-7 cm s-1,如果通透系数大于 5×10-7 cm s-1,则认为单细胞层受到了药物的影响,若通透系数大于1×10-6 cm s-1 ,则认为单细胞层遭到破坏;2. 对于主动转运,首先使用低浓度药物如10μ M或更低的浓度进行实验以避免转运蛋白的饱和转运;对于被动运输mM数量级的浓度进行实验,这样,主动运输饱和,此时的运输主要是被动运输。实验器材:细胞培养箱,细胞计数板,37 度保湿培养箱和摇床 (3 mm orbital diameter; IKA-Schuttler MTS4),37 度保温板,跨膜电阻抗(TER)检测仪,带有Millicell-ERS-voltmeter(Millipore)或 Evohm epithelial voltmeter的 Endohm 组织电阻测量室(WPI), Corning Costar Transwell permeable supports(12-well plates, cat. no. 3401),12-well cell culture clusters with lids(Corning Costar, cat. no. 3512),分析仪 器 ( scintillation...