细胞渗透性试验步骤

细胞渗透性实验步骤细胞渗透性实验实验材料：1. Caco-2 细胞；2. 培 养基 DMEM(高糖，含Gln ，无丙酮酸，Gibco/Invitrogen, cat. no. 41965-039)；a) 完 全 培 养 基DMEM+10% FCS + 1% NEAA (Gibco/Invitrogen, cat. no. 11140-035)；b) DMEM-双抗培养基 DMEM+10% FCS+1% NEAA+1%双 抗（ Gibco/Invitrogen, cat. no. 15140-122）；3. 0.25%胰酶+EDTA；4. HBSS（Hank’s balanced salt solution）(cat. no. H1387)配制 1L，加入 HEPES（终浓度 25mM）和 NaHCO3（终浓度 0.35g/L ）, 调整 PH=7.4并过滤除菌（如果要模拟小肠酸环境或研究质子依赖的转运机制，则以PH=6.5 的甲磺酸代替HEPES，终浓度 10mM，调整 PH=6.5）；5. DMSO（在药物不溶于 HBSS时使用，99.5%纯度，作为共溶剂，使用时DMSO终浓度不能超过1%）；6. [ 14C]mannitol（ supplied by NEN Life Science Products ， 具 有 放 射 性 ） 或 用fluorescent compound lucifer yellow（需要的药物浓度高于 [14C]mannitol）7. 分析药物含量的溶剂，如HPLC溶剂；8. BSA，如检测脂溶性化合物则需要BSA；9. 配制药物，用上述HBSS溶液按需要的浓度溶解药物，使用前检查配制后的溶液PH值，如PH改变，则调整相应的至7.4 或 6.5 。要点：1. 有些药物可能会破坏Caco-2 细胞层的完整性，造成通透性升高，一般以[14C]mannitol作为 marker，通常完整的 Caco-2 细胞层通透性为 1.2 ± 0.5 ×10-7 cm s-1，如果通透系数大于 5×10-7 cm s-1，则认为单细胞层受到了药物的影响，若通透系数大于1×10-6 cm s-1 ，则认为单细胞层遭到破坏；2. 对于主动转运，首先使用低浓度药物如10μ M或更低的浓度进行实验以避免转运蛋白的饱和转运；对于被动运输mM数量级的浓度进行实验，这样，主动运输饱和，此时的运输主要是被动运输。实验器材：细胞培养箱，细胞计数板，37 度保湿培养箱和摇床 (3 mm orbital diameter; IKA-Schuttler MTS4)，37 度保温板，跨膜电阻抗（TER）检测仪，带有Millicell-ERS-voltmeter（Millipore）或 Evohm epithelial voltmeter的 Endohm 组织电阻测量室（WPI）， Corning Costar Transwell permeable supports(12-well plates, cat. no. 3401)，12-well cell culture clusters with lids(Corning Costar, cat. no. 3512)，分析仪 器 （ scintillation...