细胞试验技术

（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在 sigema 网站输入基因号设计一对21 个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游 25bp 开始；4、GC 含量介于 40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’ UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅 100℃ 2min ，锅里隔夜（三）、酶切plko.1 载体1、 AgeI 酶切，反应体系：plko.1 载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer 5ulH2O 39ul37℃水浴 2~3h2、切胶回收AgeI 酶切产物， 30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37℃水浴 2~3h切胶回收， 30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4 连接：退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4 连接酶1ulH2O 2ul T4 连接酶 Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml 离心管加 33ul 感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴 60~90s，冰上放置2min ，加入无氨苄培养基，37℃摇床 1h，涂布在氨苄平板上，37℃， 16h。（六）、挑菌用枪头挑取5 个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA 与质粒 DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下， 染色体 DNA 的氢键断裂， 双螺旋结构解开而变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质－ SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。简明原理： 碱裂解法是基于DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA 变性， 再将 pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA 不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。1、取 5ml 菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清2、向沉淀加500 ul P1 ，震荡重悬3、加入500 ul P2 ，温和翻转6~8 次，充分裂解（...