聚合酶链反应PCR技术的原理

聚合酶链反应聚合酶链式反应（ polymeras chain reaction ，PCR）是 1985 年由 Kary Mulis创立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。 PCR反应可以从长链 DNA或众多 DNA中特异性地扩增某一片段。 它的灵敏度非常高， 从几个基因拷贝， 甚至一个基因拷贝就可以扩增出大量的同样片段。应用：绘制 DNA物理图谱、 DNA片段多样性、基因克隆、基因诱变、DNA序列分析等许多领域都用到PCR技术。PCR技术的原理 ：在 PCR反应的第一个循环中，包括模板DNA变性，变性后的模板 DNA与合成的引物退火，链延伸。第一个循环完成后，开始第二个循环，其方式是重复第一个循环的变性、退火、延伸⋯ ⋯温度：原核生物的 DNA模板变性， 94℃是足够的； 退火温度可以变化，一般低于 Tm值 10℃即可，如果目的基因的拷贝数极少，退火温度在开始的基个循环之中可适当降低，甚至到42℃；退火时间也可变化；链的延伸温度，一般是72℃；延伸的时间可由扩增片段的大小而定，一般认为DNA聚合酶的聚合速度是1000bp/min 。一、引物采用两个引物：Primer 1是扩增片段编码链的上游一段DNA(cDNA)；Primer 2是非编码链下游的一段DNA(cDNA)。Primer 的设计 : 1. 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，而且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异相结合，提高反应的特异性。2. Primer 的长短以扩增片段的大小而定， Primer 越长，特异性越强。扩增片段在 1kb 以内， Primer 一般以 15-30nt 为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性降低，同时引物过长还会浪费成本。3. 引物的 GC含量以 45%-55%为佳，GC应该随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。4. 引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。5. 二个引物不应有互补序列，特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。6. 引物 5’末端碱基无严格限制，在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态，因此, 可在引物 5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于 PCR产物的分析克隆等，引物的5’端最多可加 10个 bp 碱基而对 PCR反应无影响。7. 引物 3’端的 1— 2 个碱基会影响 Taq DNA聚合酶的延伸效率，从而影响 PCR反应的扩增效率及特异性，因此选择合适的3’端碱基很重要。引物3’末端碱基错配时，不同碱基的引发效率存在很大差异，当末位碱基为A 时，错...