荧光PCR定量质量控制及防污染措施

解放军第三 0 二医院 王海滨写在课前的话近几年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越广泛。但是如何进行治疗控制以及出现污染后怎样进行清除污染本文主要讲述怎样来防止污染的产生。一、荧光 PCR定量的概述（一） ?荧光 PCR定量的原理实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常规的 PCR也就是电泳 PCR，它是合成一个正向引物和反向引物为目的模板，即 DNA或 RNA作为一个模板扩增，扩增后通过跑电泳的方式来检测它存在与否，是相对量的变化。由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的几率比较高。近几年 PCR 扩增时在参入一对引物的同时参入单个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时， Taq 酶的 5' 端～ 3' 端外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有单个荧光分子构成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物构成完全同步。通过荧光物质参入和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程, 使整个 PCR过程从扩增到检测都在一个封闭的状态。荧光集团目前临床常用的有两个，一个是SYBR green，一个是 TapMan探针。 SYBR green是一类荧光染料，能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。 变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。 在扩增的过程中由变性到负性扩出了另一条链和模板DNA进行退火变成双链。 这时 SYBR green 染料与 DNA 双链结合 , 发出荧光信号。用SYBR green 荧光染料来作为指示剂时，中间要加一个溶解曲线来证实它的特异性的问题。另一个是 TapMan探针，在两个引物中间设置一条特异性的探针，它标记有荧光染料通过激发和检测的过程来检测特异性扩增模板的存在。（二） PCR原理图（三）定量原理定量原理：初始模板量的对数与 C(T) 循环数之间的线性关系。初始 DNA 量越多 , 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少。域值～Ct 值，荧光曲线由潜伏期进入对数期的拐点。Log 浓度与循环数呈线性关系（如图二），根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量图...