蛋白融合 Linker 的设计与选择接头序列 (Linker) 设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链 , 其中起连接作用的氨基酸称为Linker[1] 。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性 , 与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker 不能影响目的蛋白各自的功能。因此, Linker 序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。针对 Linker 序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的研究主要有两种, 即螺旋形式的 Linker 肽如[A(EAAAK)nA] 和低疏水性、 低电荷效应的氨基酸组成的接头 , 以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分, 使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象。Ryoichi 等[3]在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的 linker 序列, 包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性 linker 以及葡萄糖球菌蛋白 A(PA) 。结果发现螺旋状的linker 同柔性 linker 及 PA 一样 , 可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 甚至可增强融合蛋白的功能。 Linker 的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Linker 的长度过长 , 则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感 , 导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降; 应用较短的 Linker, 可以克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近导致蛋白功能的丧失。 Linker 的长度不应小于 3.5 nm , 这是由于相邻肽键的距离为0.38 nm, 因此连接肽至少应包含10 个氨基酸。目前最为常用的是Huston 设计合成的 (GGGGS)3 序列。研究发现 , 连接肽为 (Gly4Ser)3 的融合蛋白表现出较高的复性效率。 这可能是 (Gly4Ser)3 连接肽较长且柔软 , 在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。所以, Linker 的长度不能过长也不能过短。Linker 的选择 , 还应考虑 Linker 内部的氨基酸序列 , 研究发现 , Linker 组成相同但序列不同时 , 构建的融合蛋白的稳定性存在显著差异; 编码 Linker 的核苷酸组成 , 调整编码 Linker 的核苷酸组成 , 虽不改变原接头 Linker 的氨基酸序列 , 但融合蛋白的表达存在显著差异。Link...
