根癌农杆菌介导植物基因遗传转化技术VIP免费

根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术常用的植物基因转化技术•农杆菌介导法•植物病毒载体介导法（如CaMV）•DNA直接导入法（PEG介导法、脂质体法、基因枪法、电激法、激光微束法、显微注射法等）•种质系统介导基因转化（花粉管通道法等）•其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐若干主要的植物细胞转化方法的比较评价内容植物转化方法农杆菌法PEG法电击法微注射法基因枪法花粉管通道法受体材料外植体原生质体悬浮细胞细胞或组织外植体卵细胞宿主限制有无无无无开花植物培养条件简单复杂复杂复杂简单无转化频率10-2~10-110-5~10-410-5~10-410-2~10-110-3~10-210-1~101嵌合体有无无无或有多无操作简单简单复杂更复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵简便工作效率高低低更低高低若干主要的植物细胞转化方法的比较方法优点缺点农杆菌介导法转化效率高主要以单拷贝或低拷贝形式插入不需要特殊的专用设备只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞化学法及电激法操作简单转化效率高同一实验可处理许多样品化学法不需要特殊的专用设备外源DNA重排率高，常为多拷贝形式插入化学法需通过原生质体培养及其再生体系，才能产生有体细胞克隆变异的风险基因枪法不受物种界限的约束可用于不同的转化样品，如根、茎、叶、愈伤等需复杂的专用设备外源DNA重排率高，常为多拷贝形式插入显微注射法不受物种界限的约束可用于不同的转化样品，如根、茎、叶、愈伤等需昂贵的专用设备需接受专门训练的技术人员进行操作与植物基因转化有关的农杆菌•根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）：含有Ti(Tumor-inducingplasmid)质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。•发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）：含有Ri(root-inducingplasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。•根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒都具有一段转移DNA(transferDNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到甚至150kb的外源基因，因此，Ti质粒和Ri质粒已成为植物基因转化中的理想载体系统。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)•在植物基因工程的发展中,研究最清楚和应用最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化,在已获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌介导完成的.起初,人们认为农杆菌仅能转化双子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物;而近几年,由于在一些重要的单子叶植物以及在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片段DNA等优点又受到了人们极大的关注.Ti质粒•Ti质粒（tumor-inducingplasmid）：Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中有一段DNA，称为T-DNA（transfer-DNA），能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成•Ti质粒可分为4个功能区域：•①T-DNA区：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因；•②Vir区：Vir区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性；•③Con区(接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移；•④Ori区(复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。Ti质粒介导转化的过程•农杆菌吸附于植物的表面伤口部位•受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝（T-链）•T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中•T-DNA在植物细胞中表达整个过程大致可分为以下几个步骤①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化；④T-DNA复合体的产生；⑤T-DNA复合体...