试验一硫酸苯酚法测多糖含量VIP专享

实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm 处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至 100 mL 的 1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL 该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得 100 ug/mL 的葡萄糖标准液。2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚 90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得 90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将 90%苯酚液稀释至 6%，即一体积储存液对应十四体积纯水， 临用现配。6. 实验步骤表 1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 取 8 支干净的具塞试管按表2 方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml 的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却 10min,以 0 号作为空白调零 ,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度 X 为横坐标（ug/mL），吸光度 Y 为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL 软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。二、实验原理游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物， 糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在 620nm 处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。 用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总...