噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。2.噬菌体的纯化（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培养12~24h；（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化；（4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止注意事项1.使用仪器要保证是灭菌的；2.注意琼脂的浓度；3.氯仿是易燃品，应远离火焰一、生物测定法1、双层琼脂平板法1）倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。2）倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL，上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。3）恒温培养30℃恒温培养6～12h观察结果。4）观察结果如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──噬菌斑。2、单层琼脂平板法省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。噬菌体效价的测定1、倒平板将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。2、稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。噬菌体与菌液混合将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。接种上层平板将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应...
