cDNA文库的构建和筛选VIP免费

第五章第五章cDNAcDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选将将RNARNA转变成转变成cDNAcDNA以及以及cDNAcDNA文库构建文库构建cDNAcDNA文库筛选策略文库筛选策略cDNAcDNA表达文库的功能筛选表达文库的功能筛选用用cDNAcDNA检测基因的表达检测基因的表达体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因细胞中总RNA•信使RNA(mRNA):1-5%.作为蛋白质合成的模板。•核糖体RNA(rRNA):>80%.构成核糖体，参与蛋白质翻译•转运RNA(tRNA):10-15%.将mRNA中的信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）信使RNA的表达在生物体内具有组织和时空特异性。因此，mRNA对于了解细胞中的信息流非常重要.•Size–examinedifferentialsplicing（检测可变剪接）•Sequence–预测蛋白产物•Abundance–检测表达水平•Dynamicsofexpression–不同的时间、发育阶段和组织的特异性。mRNA特点第一节：将第一节：将mRNAmRNA转变成转变成cDNAcDNAcDNAcDNA：与：与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA，称为，称为cDNAcDNA。。由某个生物体的某个器官或组织由某个生物体的某个器官或组织mRNAmRNA反转录形成的总反转录形成的总cDNAcDNA，构建形成的基，构建形成的基因文库，称之为因文库，称之为cDNAcDNA文库文库RNADNA2´OHgroup(ribose)2´H(deoxyribose)UracilbindsAdenine(A,U,C,G)ThyminebindsAdenine(A,T,C,G)MultipletypesandrolesOnebiologicalformOftenpermanentlymodifiedviasplicingPermanentlymodificationsarerare(mutation)Usuallysingle-strandedDoublestrandedIntermolecularbindingDoublehelixstructure一、mRNA的分离纯化一、一、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化RNARNA在体内具有容易被在体内具有容易被内切核酸酶（内切核酸酶（RNaseRNase））降解降解以及自然降解的特性。分离以及保存以及自然降解的特性。分离以及保存RNARNA需针需针对上述特点进行。对上述特点进行。加入加入RNaseRNase抑制剂抑制剂第一节：将第一节：将mRNAmRNA转变成转变成cDNAcDNARNA分离•TotalRNAfrombiologicalsamples–Organicextraction–Affinitypurification•mRNAfromtotalRNA–Oligo(dT)resins•mRNAfrombiologicalsamples–Oligo(dT)resinsRNA分离从生物体内分离totalRNA（有机分离法）Lyse/homogenizecells加入酚:氯仿:异戊醇到裂解细胞中并离心Organicphaseseparatesfromaqueousphase•有机相在底层•水相在上层(containstotalRNA)•洗白破碎物以及大片段的基因组DNA在两相界面吸取上清至新管乙醇沉淀RNA并用水重新溶解用层析柱分离总RNALysecells,andspintoremovelargeparticulates/celldebrisApplylysate(containingnucleicacidsandcellularcontaminants)tocolumnwithglassmembrane用乙醇洗涤柱子，核酸结合在柱子上，其他物质从侄子中流出。用DNase处理污染的DNAApplywatertothecolumn;purifiedRNAwashesofftheglassandiscollected•mRNA的3’末端具有polyA尾巴•Oligo(dT)探针用于分离总RNA中的mRNA•mRNAcanbeelutedfromoligo(dT)matrixusingwaterorlow-saltbufferMessengerRNAIsolationMessengerRNAIsolation二、二、cDNAcDNA的合成的合成AA、用、用polyTpolyT作为引物作为引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTAGGAGTTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物第一节：将第一节：将mRNAmRNA转变成转变成cDNAcDNAB、基因特异的引物C、随机引物第一节：将第一节：将mRNAmRNA转变成转变成cDNAcDNA在构建在构建cDNAcDNA文库之前，需要将单链文库之前，需要将单链cDNAcDNA合合成双链，主要有以下二种种方法：成双链，主要有以下二种种方法：AA、降解、降解mRNA-cDNAmRNA-cDNA杂合链中的杂合链中的RNARNA，，cDNAcDNA第一链第一链33’’端回折充当引物，形端回折充当引物，形成第二链成第二链mRNAcDNAAAAAAAAAATTTTTTTTTBB、用来自、用来自E.coliE.coli中的中的RNaseHRNaseH降解的降解的RNARNA充当引物，在充当引物，在DNADNA聚合酶和连接酶聚合酶和连接酶的作用下合成第二链的作用下合成第二链DNADNA第一节：将第一节：将mRNAmRNA转变成转变成cDNAcDNAmRNAcDNATTTTTTTTT...