1蛋白质免疫印迹技术详解1一、WesternBlot简介二、WesternBlot一般流程三、WesternBlot成像系统四、WesternBlot常见问题分析主要内容1一、WesternBlot基本原理1一、WesternBlot优点1.高分辨率的电泳技术2.特异敏感的抗原-抗体反应3.1-5ng中等大小的靶蛋白1一、WesternBlot应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其它蛋白、RNA的互作1蛋白样品的制备SDS-PAGE电泳转膜（PVDF或NC膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显影二、WesternBlot一般流程LB：62.5mmol/LTris-HCl（pH6.8at25℃）,2%SDS，10%Glycerol(甘油)，50mmol/LDTT(二硫苏糖醇)；溴酚蓝在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！蛋白样品的制备71①SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。②强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。③蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其形状及所带电荷的性质无关。蛋白样品的制备1蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒;（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS;（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的;（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比;Bradford法：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收Lowly法：第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。蛋白样品的定量1011.不连续的电泳缓冲体系。2.SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳1不连续电泳系统作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统1聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel，简称PAG):单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)催化剂过硫酸铵三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431020-807.536-945.057-2121411灌制分离胶隔绝空气ddH2O乙醇1灌制浓缩胶插入梳子1StakinggelSeparatinggel上样1电泳转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转4h或过夜。20膜的选择1.PVDF膜（polyvinylidenefluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。2.PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的蛋白选用0.2um的膜。3.预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。211湿转系统转膜23蛋白x(kDa)转膜液转膜条件x<20甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），用水定容至。250mA恒流转3hrs20
