常用克隆载体VIP免费

基因工程常用的克隆载体克隆载体目的基因进入细胞必须要有载体（vector）的运载作用才能实现。载体运载外源DNA至宿主细胞，是通过载体自身DNA的核酸序列中插入了外源DNA，再进入宿主细胞内进行的DNA复制，在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得了复制（扩增）和表达。克隆载体根据目的基因的要求，克隆载体可分为：原核基因克隆载体真核基因克隆载体大致是质粒、噬菌体、粘粒等大致是人工质粒、Ti质粒、单链噬菌体、SV40杆状病毒及腺病毒等克隆载体载体的报告基因：基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可以证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其它细胞中识别区分甚至挑选出来。这种具有标志意义的基因称为报告基因（reportergene）或标记基因。抗药性基因、GUS基因、LacZ基因、β珠蛋白基因和人生长激素基因、发光基因等。质粒载体能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中总以独立于染色体之外的方式存在。理论上，所有的细菌株系都含有质粒。质粒DNA的分子构型松弛线性的L构型松弛开环的OC构型超螺旋的SC构型质粒载体pBR322本图所表数字是以EcoRI位点中央计为0，从顺时针方向计算，至各酶切位点的第一个碱基的数。在圆的内部所表示的各限制酶是在pBR322DNA上只有一个酶切位点的酶，圆外所表示的各酶是在pBR322DNA上有2个至3个的酶切位点的酶，（）内的数是酶切位点数质粒载体pUC19本图所表数字是以TCGCGCGTTT的第一个T作为1，从顺时针方向计算，至各酶切点的第一个碱基的数。在圆的内部所表示的各限制酶是在pUC19DNA上只有一个酶切位点的酶,圆外所表示的各酶是在pUC19DNA上有2个至3个的酶切位点的酶，（）内的数是酶切位点数。此外，圆外还列举了多克隆位点限制酶切点的分布图质粒的命名pUC118p代表质粒，UC是质粒的作者名（或实验室名）118代表构建的一系列质粒的编号。其他重要的质粒载体pGEM系列具有两个来自噬菌体的启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。反应体系中若加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别仅仅在于T7和SP6两个启动子的位置互换、方向相反而已。pSP系列用的是噬菌体SP6的RNA聚合酶启动子具有一段来自M13噬菌体的多克隆位点序列pSP64和pSP65的差别是多克隆位点区的取向彼此相反。穿梭质粒载体是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带外源DNA在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体表达载体构建一个合适的原核表达载体的基本要求:有一个强启动子及其两侧的调控序列；有SD序列且该序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离；在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有不依赖ρ因子(Rhofactor)的转录终止区。Shine-Dalgarnosequence;SDsequence因澳大利亚学者夏因(Shine)和达尔加诺(Dalgarno)两人发现该序列的功能而得名。信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核16S核糖体RNA或真核18SrRNA3′端富含嘧啶的7核苷酸序列互补的富含嘌呤的3～7个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与mRNA结合并形成正确的前起始复合体的一段序列。λ噬菌体载体1974年发现当λ噬菌体载体失去某一部分达总量20%的DNA时仍不失活，这一部分缺失DNA的空间正好作为运载外源DNA之用，第一次证明了λ噬菌体载体作为基因无性繁殖载体的可能性。至今已构建100多种λ噬菌体载体。λ噬菌体载体在λ噬菌体载体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5‘单链突出序列，即通常所说的粘性末端，由粘性末端结合形成的双链DNA区段称为cos位点。λ噬菌体线状的DNA分子环状加热到60度后慢慢冷却加热到70度后迅速冷却λ噬菌体环化状态下，48502个碱基对，61个基因。整个λ噬菌体基因组可以大致划分为三个区段（1）左侧区段：从A到J，约占1/3，包括头部及尾部蛋白质合成及装配所需的全部基因。（2）中间区段：从J到N，...