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单克隆抗体制备技术2008年11月6日杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理1：HAT选择培养基：次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨基蝶呤(aminopterin,A)胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).2：细胞的DNA合成一般有两条途径：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与反应。B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。杂交瘤技术的基本原理HAT培养基的选择原理：A：氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨基蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。B：瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。C：B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降)。D：融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。免疫程序与检测方法的建立免疫程序建立检测方法检测免疫效果免疫程序取6-8周龄Balb／C雌鼠，首免，每只鼠用0.5mL含50µg的重组蛋白与10%体积的ISA15AVG佐剂混匀，颈背部皮下多点注射；间隔3w进行二免，免疫原、剂量和方法同上；再间隔2w进行三免，免疫原不含佐剂，腹腔注射，剂量同上。细胞融合前3d加强免疫，腹腔注射0.5mL含50-100µg纯化的蛋白。3-5天后用于融合。免疫程序免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100g，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06-1×107。检测方法的建立及免疫效果的评价A：建立成熟的检测方法是关键，一般有以下几种方法：ELISAIPMA免疫荧光B：免疫效果的评价一般于三免疫后一周，通过尾静脉采血检测抗体产生情况，一般以稀释1000倍仍为阳性判为免疫成功。杂交瘤细胞株的建立SP2/0细胞的准备饲养层细胞的制备免疫脾细胞的制备融合阳性杂交瘤的筛选细胞的冻存与复苏单克隆抗体的制备SP2/0细胞的准备SP2/0细胞在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。融合前24-48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养，融合前6h，弃去瓶中培养液，换上新液。融合时，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于15mL离心管内，1000rpm离心5min，用5mL无血清的1640悬浮沉淀，再离心一次，然后用无血清的1640培养液重新悬浮，细胞计数，取107细胞悬液备用。饲养层细胞的制备融合前一天制备饲养细胞，一般选用8周龄Balb/C小鼠腹腔巨噬细胞，步骤如下：1.将Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做阴性对照），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。2.用无菌剪刀剪开皮肤，用无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜。3.用5mL无菌注射器吸取5mLHAT选择培养液注入到小鼠腹腔中（严禁刺破肠管），注射器不拔出，然后用无菌镊子轻轻触动几次左右两侧腹膜，吸出营养液。4.重复1次上步操作，补足20mLHAT选择培养液，混匀后加入2块96孔板，100μL/孔，放入37CO℃2培养箱培养。（此为经验操作，标准操作要进行细胞计数，浓度为1×105/mL；如果做2块饲养细胞，吹两次即可，如果做3块则加吹一次）免疫脾细胞的制备加强免疫3-5天后小鼠眼球采血（作为阳性对照，尽量多的采血，否则脾中红细胞较多，影响融合），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。用无菌剪刀剪开皮肤，无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜；再用无菌剪刀剪开腹膜，暴露脾脏；无菌取脾脏，无血清1640洗一次，去除结缔组织；无菌注射器吸取1640培养液，将脾细胞吹出；1000rpm离心5min，细胞用1640培养液洗1次，细胞计数，取5×107-1×108脾细胞悬液备用。融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10-1：5的比例混合在一起，在15mL离心管中用无血清1640洗1次，离心，1000rpm,5min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响PEG浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。60s内加入37℃预温的1mL50%PEG溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴静置作用90s。加37℃预温的1640培养液以终止PEG作用，首先，1min加入1mL，然...