第七章 腺相关病毒载体

腺相关病毒载体腺病毒相关病毒（adenovirusassociatedvirus,AAV）是一类单链线状 DNA 缺陷型病毒。其基因组 DNA 小于 5kb,无包膜，外形为裸露的 20 面体颗粒。AAV 不能独立复制,只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时,才能进行复制和溶细胞性感染,否则只能建立溶源性潜伏感染。腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒 adeno-associatedvirusAAV）是简单的非致病性单链 DNA 病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。基因组两端为末端反向重复序列（ITR）,中间基因组编码两个蛋白：Cap 和 Rep。ITRs 对于病毒的复制和包装具有决定性作用。Cap 蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep 蛋白参与病毒的复制和整合。AAV 能感染多种细胞。Rep 蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第 19 号染色体的特异位点：AAVS1 位点。这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物 DNA 病毒。重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。优点：以潜伏感染为主；AAV 可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。缺点：AAV 载体容量小，目前最多只能容纳 5kb 外源 DNA 片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在 40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。AAV 选择的条件1.治疗基因的长度不能过大。AAV 的总容量 4.7kb,还要包括 AAV 自身的 ITR，启动区和 RNA 加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AAV 载体对靶细胞具有较高的转导效率。AAV 病毒的感染细胞AAV 载体对于骨骼肌、视网膜、肝细胞、心脏平滑肌细胞、神经元细胞、胰岛 B细胞、关节滑膜细胞等具有良好的感染效果，而对于淋巴细胞、造血干细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞等感染效果较差。病毒的加样量病毒量为 10-10V.P/Cell 时最佳。如果太低，基本检测不出，最低加病毒量为10VP/CelL 才能检出目的蛋白...