第六章核酸的分离与纯化王文君广州中医药大学分子生物学技术实验室免疫研究室一、概述•核酸分离提取的原则•常用方法及基本原理•DNA的分离纯化•RNA的分离纯化第一节核酸分离提取的原则•一、基本原则•1.保证核酸一级结构的完整性。•2.排除其它分子的污染。•二、注意事项•1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。•2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。•3.减少物理因素对核酸的降解。•4.防止核酸的生物降解。•三.主要步骤：•1.破碎细胞。•2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等生物大分子。•3.去除其它不需要的核酸分子。•4.沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。•5.核酸纯化。•核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。只有采取合适的核酸提取方法，才可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。下面介绍核酸分离纯化的基本方法及不同来源DNA的分离提取方法。第二节分离制备核酸的常用方法及基本原理•一.溶解法：•酚/氯仿抽提法的基本原理•1.交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白杂质的效果。•2.氯仿与苯酚混合使用，对于RNA的提取显得更加重要，因酚可有效变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶的活性。而且酚能溶解10～15%的水，从而溶解部分Poly（A)RNA。•3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。•4.用水饱和的乙醚抽提最后一次，彻底去除迹量酚和氯仿。然后68℃水浴10分钟蒸发迹量乙醚。•5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。•酚/氯仿抽提法标准程序是：•酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次。蛋白杂质有机相水相（核酸溶液）•高速离心后的分层情况（酚/氯仿抽提法）•注意事项：•1.一般酚是透明无色的结晶。酚结晶如呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物如醌、二酸等。变色的酚溶液不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。•2.酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平衡使其pH值在7.8以上。制好的饱和酚贮于棕色瓶中4℃可保存1个月。因酚的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的pH值＞8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。•二、层析法•利用物质在静止相和移动相之间分配系数的差异，进行物质的分离和纯化的技术称为层析。层析体系中一般由两个互相不溶的介质组成，静止相多为固体，移动相多为液体。•羟磷灰石是一类特殊的层析材料，对核酸有较大的亲和力，并在大多数条件下不吸附蛋白质和多糖，所以能纯化核酸。双股DNA与羟磷灰石的结合较牢固，如将细胞的溶解液流经羟磷灰石柱，然后用低浓度磷酸缓冲液流洗，以去除RNA、蛋白质及其它物质。随即再用浓度高的磷酸缓冲液洗脱，即可获得DNA。•三、电泳法•凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。常用于核酸分离的凝胶电泳主要有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。•四、超速离心法•根据核酸分子的物理特性如分子量、密度等的不同，可用密度梯度超速离心的方法加以分离纯化。•1.CsCl沉降平衡超速离心•CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方法：•①可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三种结构分子与EB结合能力不同（L>OC>CC），EB插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越多、浮力密度越小。。•②可分离双链DNA分子的两条互补链。•③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒，如图1。图1氯化铯梯度纯化λ噬菌体噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。•④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉于管底，从而达...
