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WesternBlot蛋白免疫印迹法

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3 Western blot3.1 试剂配制1)30%聚丙烯酰胺储备液(Acr/Bis):丙烯酰胺(Acr),29g;N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis),1g,去离子水溶解,37℃水浴助溶,定容至 100mL。0.45μ m 滤器过滤,棕色瓶 4℃避光保存。2)10%十二烷基硫酸钠(SDS):SDS,10g;H2O,80mL。68℃加热溶解,浓 HCl 调 pH 至 7.2,定容至 100mL,室温保存。3)10%过硫酸铵(AP):AP,1g;H2O,10mL。避光,4℃保存。(4℃2 周)4)分离胶缓冲液(1.5MTris-HCl pH8.8):Tris,18.17g;H2O 80mL。用浓 HCl 调 pH 至 8.8,定容至 100mL,4℃保存。5)浓缩胶缓冲液(1.0MTris-HCl pH6.8):Tris,12.11g;H2O 80mL。用浓 HCl 调 pH 至 6.8,定容至 100mL,4℃保存。6)电泳缓冲液(10×):甘氨酸(Glycine),188g;Tris 30.2g;SDS,10g;H2O,800mL。调节 pH 至 8.3,定容至 1L,4℃保存(用时稀释为 1×)。7)5×SDS-PAGEloadingBuffer(5mL):1MTris-HCl(pH6.8),1.25mL;SDS,0.5g;溴酚蓝(BPB),25mg;甘油,2.5mL;加去离子水定容至 5mL。充分混匀,分装成 500μ L/份,室温保存。使用前每份加入 25μ Lβ -巯基乙醇(2-ME),加入 2-ME 的 loading buffer 可在室温下保存一个月左右。8)考马斯亮蓝染色固定液:40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇,室温保存9)考马斯亮蓝染色液:考马斯亮蓝 R-250,250mg;甲醇,45ml;冰醋酸,10ml;H2O,定容至 100ml。室温保存。10)考马斯亮蓝染色脱色液:醋酸,100ml;乙醇,50ml;dH2O 850ml,充分混合,室温保存11)膜转移缓冲液:甘氨酸,2.9g;Tris,5.8g;SDS,0.37g;加 H2O 600mL 充分溶解,加 200mL甲醇,混匀,定容至 1L,室温保存。12)TBS 缓冲液:NaCl,8.8g;1M Tis-HCL(pH 8.0),20ml,加入约 800 H2O 搅拌溶解,定容至 1L,4℃保存。13)TBST 缓冲液:NaCl,8.8g;1M Tis-HCL(pH 8.0),20ml,加入约 800 H2O 搅拌溶解,加入 0.5 mlTween 20 后充分混匀,去离子水定容至 1L,4℃保存。14)1M Tis-HCL(pH 8.0):Tris 121.1g 置于 1L 烧杯,加入约 800ml 去离子水,充分搅拌,加入浓 HCL 约42ml ,定容至 1L,高压灭菌,室温保存。3.2 Western blot 电泳、转膜及显色过程3.2.1 清洗将玻璃板洗净,用 ddH2O 冲洗,然后晾干。封板时保证支架与底座胶条契合,固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手,固定即可,不要用力...

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