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RT-PCR的具体步骤

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RT-PCR 实验步骤一. 实验器具:1. 移液枪:lmk200Uk20Uk10Hk2.5UI2. 吸头:lmk200Ul、20UI3. 匀浆管:5ml4. EP 管:1.5mk500Ul、200UI5. 试剂瓶:棕色试剂瓶(广 II,放 75%乙醇)6. 量筒:100ml7. 容量瓶:1000ml8. 试管架:5ml、1.5ml、20PI9. 铝制饭盒:1-2 个10. 大瓷缸:1 个11. 锡泊纸:一卷12. 卷纸:2 卷13. 三角烧瓶:带盖,稍大二. 实验器具处理1. 塑料制品:(包括枪头、EP 管、匀浆管等)先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中(注意:小枪头要充分浸泡,必要时需要针筒打入 DEPC 水),过夜后取出(注意:DEPC 水很难自然晾干,所以建议先将刚取出的 DEPC 物品甩干,枪头装入枪头盒后甩干,EP 管和匀浆管装入饭盒后甩干,然后在 37 度孵箱烘干)°高压后烤干备用。如果 DEPC 处理过的物品时间已超过一个星期,再次使用前应再次高压。2. 玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,先泡 1%°DEPC 过夜,再蒙锡纸烤干备用。3. 匀浆器:(包括剪刀、蹑子)先洗净后,超声消毒即可(不需要泡 DEPC)o三. 试剂配制1.DEPC 水:吸出 1mlDEPC 放在 1000ml 容量瓶中加双蒸水定容至 1000ml,配成 1%ODEPC 水,并充分振荡混匀备用。2.75%乙醇:用无水乙醇+DEPC 水配,然后放-20°C 保存(DEPC 水需先高压,高压时注意:1.装 DEPC 水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头;2.高压时间在 40-45 分钟,所以水要适当多加一点;3.高压结束后,不要强行放气,要让压力自然下降,不然水会喷出)。3.异丙醇:放入棕色瓶中。4.氯仿:放入棕色瓶中。5.琼脂糖四. 缓冲液配制1.电泳缓冲液(5XTBE 贮存液):Tris54g>硼酸 27.5g、0.5MEDTA20mlpH8.0,加蒸溜水至 1000mlo使用时,将 5XTBE 桥释 10 倍成 0.5XTBE 就可以在电泳时使用(工作浓度)2.上样缓冲液(6X 缓冲液,4°C 保存):0.25%澳酚蓝、0.25%二甲苯青 FF、30%甘油五. 琼脂糖凝胶配制1.1.0%:l.Og 琼脂糖+100ml 电泳缓冲液,微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶,一定要煮透,以不出现泡沫为标志),熔化的琼脂物冷却至 60°C 时加入 10mg/ml 澳化乙锭 2.5ul,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温卞放置 30-45min(可以放入 4 度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。2.1.5%:同上,将琼脂糖的量改为 1.5g六. 需购置材料Taq 酶(-20 度保存)(配 10Xbuffer 和 MgCI2):不需要使用高保真 Taq ...

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