RT-PCR的具体步骤

RT-PCR 实验步骤一. 实验器具：1. 移液枪：lmk200Uk20Uk10Hk2.5UI2. 吸头：lmk200Ul、20UI3. 匀浆管：5ml4. EP 管：1.5mk500Ul、200UI5. 试剂瓶：棕色试剂瓶（广 II,放 75%乙醇）6. 量筒：100ml7. 容量瓶：1000ml8. 试管架：5ml、1.5ml、20PI9. 铝制饭盒：1-2 个10. 大瓷缸：1 个11. 锡泊纸：一卷12. 卷纸：2 卷13. 三角烧瓶：带盖，稍大二. 实验器具处理1. 塑料制品：（包括枪头、EP 管、匀浆管等）先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中（注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入 DEPC 水），过夜后取出（注意：DEPC 水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的 DEPC 物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP 管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在 37 度孵箱烘干）°高压后烤干备用。如果 DEPC 处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。2. 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡 1%°DEPC 过夜，再蒙锡纸烤干备用。3. 匀浆器：（包括剪刀、蹑子）先洗净后，超声消毒即可（不需要泡 DEPC）o三. 试剂配制1.DEPC 水：吸出 1mlDEPC 放在 1000ml 容量瓶中加双蒸水定容至 1000ml,配成 1%ODEPC 水，并充分振荡混匀备用。2.75%乙醇：用无水乙醇+DEPC 水配，然后放-20°C 保存（DEPC 水需先高压，高压时注意:1.装 DEPC 水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在 40-45 分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出）。3.异丙醇：放入棕色瓶中。4.氯仿：放入棕色瓶中。5.琼脂糖四. 缓冲液配制1.电泳缓冲液（5XTBE 贮存液）:Tris54g＞硼酸 27.5g、0.5MEDTA20mlpH8.0,加蒸溜水至 1000mlo使用时，将 5XTBE 桥释 10 倍成 0.5XTBE 就可以在电泳时使用（工作浓度）2.上样缓冲液（6X 缓冲液，4°C 保存）：0.25%澳酚蓝、0.25%二甲苯青 FF、30%甘油五. 琼脂糖凝胶配制1.1.0%：l.Og 琼脂糖+100ml 电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾（如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志），熔化的琼脂物冷却至 60°C 时加入 10mg/ml 澳化乙锭 2.5ul,充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温卞放置 30-45min（可以放入 4 度冰箱加快琼脂糖凝固）后现进行电泳。2.1.5%:同上,将琼脂糖的量改为 1.5g六. 需购置材料Taq 酶（-20 度保存）（配 10Xbuffer 和 MgCI2）：不需要使用高保真 Taq ...