琼脂糖凝胶电泳技术

1、实验目的： 学习与掌握 DNA 电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度、含量以及分子量，及分离不同大小 DNA 片段。 2、实验原理： 电泳概念及种类* • 电泳： 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象 电泳基本原理 迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算： Ｕ =υ /E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt Ｕ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ 为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E 为电场强度（ V·cm-1）；d 为颗粒泳动的距离（cm）；l 为滤纸有效长度（cm）；V 为实际电压（V）；t为通电时间（s 或 min）。通过测量 d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。 1 迁移率单位= 10-5 cm2·V-1·min-1 在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数 颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。 迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素* 电场强度 溶液的pH 值 溶液的离子强度 电渗现象 温度的影响 支持物的影响 电泳的分类 按分离原理分类： 1.区带电泳 2.移界电泳 3.等速电泳 4.聚焦电泳 按有无固体支持物分类 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 DNA 的大小 DNA 的构象* 琼脂糖浓度* 缓冲液* 不同构像质粒 分离不同大小 DNA 片段的合适琼脂糖凝胶浓度 缓冲液 TAE：乙酸盐缓冲液 TBE：硼酸盐缓冲液 TPE：磷酸盐缓冲液 实验操作 1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置。 2. 按水平板的长×宽×0.5cm 胶厚，量取0.5×TBE，并按0.7％的浓度称取agarose 琼脂糖，在微波炉或电炉上加热至全熔* （清澈透明）。 3. 等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入 1 mg/L 溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5ug/mL ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡，插入梳子*。 4. 凝固后，将梳子轻轻拔出。 5.去掉胶带，将水平板放入加有 0.5×TBE 电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。 6.在parafilm 膜上依次加： ddH2O 6ul 上样 Buffer 2ul DNA 4ul 分别混匀后点样，记录点样次序。 7. 在水平板两边的点样孔中分别加入 6 μ l 的λΔΝΑ/EcoRI+Hin dIII marker*。 8. 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（...