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琼脂糖凝胶电泳技术

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1、实验目的: 学习与掌握 DNA 电泳的技术方法,利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度、含量以及分子量,及分离不同大小 DNA 片段。 2、实验原理: 电泳概念及种类* • 电泳: 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象 电泳基本原理 迁移率(或泳动度)是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度,可用下列公式计算: U =υ /E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt U为迁移率(cm2·V-1·min-1);υ 为颗粒泳动速度(cm·s-1);E 为电场强度( V·cm-1);d 为颗粒泳动的距离(cm);l 为滤纸有效长度(cm);V 为实际电压(V);t为通电时间(s 或 min)。通过测量 d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。 1 迁移率单位= 10-5 cm2·V-1·min-1 在确定的条件下,某物质的迁移率为常数,是该物质的化学特征常数 颗粒带净电荷多,直径小而接近于球形,则在电场中泳动速度快,反之则泳动速度慢。 迁移率还与分子的形状,介质粘度,颗粒所带电荷有关,迁移率与颗表面电荷成正比,与介质粘度及颗粒半径成反比。 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素* 电场强度 溶液的pH 值 溶液的离子强度 电渗现象 温度的影响 支持物的影响 电泳的分类 按分离原理分类: 1.区带电泳 2.移界电泳 3.等速电泳 4.聚焦电泳 按有无固体支持物分类 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 DNA 的大小 DNA 的构象* 琼脂糖浓度* 缓冲液* 不同构像质粒 分离不同大小 DNA 片段的合适琼脂糖凝胶浓度 缓冲液 TAE:乙酸盐缓冲液 TBE:硼酸盐缓冲液 TPE:磷酸盐缓冲液 实验操作 1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住,形成一个胶模并水平放置。 2. 按水平板的长×宽×0.5cm 胶厚,量取0.5×TBE,并按0.7%的浓度称取agarose 琼脂糖,在微波炉或电炉上加热至全熔* (清澈透明)。 3. 等凝胶温度降至大约50-60℃以下时,加入 1 mg/L 溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5ug/mL ;摇匀并轻快地倒入水平板中,除掉气泡,插入梳子*。 4. 凝固后,将梳子轻轻拔出。 5.去掉胶带,将水平板放入加有 0.5×TBE 电泳缓冲液的电泳槽中,并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。 6.在parafilm 膜上依次加: ddH2O 6ul 上样 Buffer 2ul DNA 4ul 分别混匀后点样,记录点样次序。 7. 在水平板两边的点样孔中分别加入 6 μ l 的λΔΝΑ/EcoRI+Hin dIII marker*。 8. 盖好电泳槽盖子,选择适当的电泳电压(...

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