第四章细胞原代培养VIP免费

上节要点回顾•细胞培养用液主要包括哪些•血清的主要作用•血清细胞培养基•无血清细胞培养基•消化液活力•PH调整液第四章细胞原代培养第四章细胞原代培养本章重点：了解并能掌握原代培养的过程。自己设计某种细胞的原代培养并论证其的可行性。一、原代培养的概念1定义：从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养。通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。2含义①初次培养，不更换培养物的生长器皿②原代培养中的“代”不是指细胞的“代”数，原代培养物中的细胞在接种之后，并不一定没有分裂增殖。③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液也不等于不更换培养器皿。④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需用要分割培养物为较小的部分再培养。二、原代培养的过程取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养箱中培养。1取材及培养材料的制备（1）准备工作主要是对所涉及的器具、用品的灭菌以及实验者、实验动物的清洁与消毒。①解剖器械和器具②工作台面③操作者④实验动物（2）取材及培养材料的制备①取目的组织块，洗涤、去脂、被膜、以及坏死组织。②1mm3组织块放于培养液中植块培养。③剪碎加入胰蛋白酶消化液。④将制成的细胞悬液用（不锈钢网筛）过滤。⑤离心。⑥弃上清液，将细胞溶液用少量培养液重新悬浮为细胞悬液。⑦用血细胞计数板计数细胞密度。⑧培养液调至期望密度，准备接种。（3）几种常用实验动物的取材胚胎动物的取材：胚胎动物是体外培养常用的实验动物。由于胚胎生存于母体子宫内或者蛋壳内（鸟类），取材时主要注意对母体动物或者蛋壳进行消毒。（38℃、40～70%湿度、21d）保存，4～10℃，10da.将孵育一定时间的受精蛋取出，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。b.受精蛋大头朝上，钝器击破，尽可能大些，去碎片，撕膜，暴露出尿囊绒毛膜后附着的血管。c.用弯镊子撕破尿囊绒毛膜，然后轻轻夹住鸡胚的颈部，托出鸡胚。放到事先盛有培养液的培养皿内。备用。鸡胚：鼠胚：a.取一定妊娠天数的孕鼠，处死或麻醉。b.分别用碘酒与酒精棉球擦拭孕鼠腹部进行消毒。然后切开或剪开孕鼠腹部皮肤，暴露腹部肌肉。c.沿腹中线切开或剪开腹肌，暴露内脏。用剪刀和镊子解剖出包含鼠胚的子宫，放置在一事先盛有培养用液的培养皿内，稍事清洗后，换入另一培养皿内。d.撕破或剪开子宫，取出所有胚胎。置入一新的盛有培养用液的培养皿内，洗去血污。备用。a.切取所要脏器或大组织块。对于带有鞘膜的器官如睾丸，取材时争取连同鞘膜一起切取。b.取后迅速置于冰冷的已加入抗生素溶液的培养液或平衡盐溶液中，在密封的容器内尽快运送到培养室处理。c.材料送到培养室以后，要尽快更换抗生素溶液并将组织块切成小块，然后放置到培养液中。备用。成年动物取材皮肤标本取材通过手术进行取材，取材时75%乙醇消毒两次（不能用碘酒），然后进行表皮层与真皮层的分离，消化，分别培养。2分离（散）细胞的方法取材后，若要进行分离（散）细胞培养，紧接着的一个工作就是将所有取得组织分离成细胞悬液，方法有多种。最常用的是机械解离细胞法，酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。Ⅰ机械细胞分离法：主要适用于质地较软，内含纤维性成分较少，而且对机械分离较具耐受能力的组织，例如，胚胎组织，成年的脑组织、肝、肿瘤等。抽吸法：器材：细口径吸管、移液器、试管、培养瓶步骤：①洗涤②吸吹到组织块上至消散为止。③离心（1000r/m，5min）④弃上清，重制细胞悬液，计数。过网/筛法器材：不锈钢网筛，粗大空针内芯，培养皿，烧杯，吸管，离心管步骤：①漂洗组织。②放置网筛，用内芯挤压过网进入下面的培养液中。③用网筛再次过滤，离心，1000r/min，5min。④再制细胞悬液，备用。机械解离细胞法的优缺点：所需时间短，原则上这种方法对于分化程度较高的细胞如成熟的神经细胞、肌肉细胞易造成伤害，细胞的存活率相对较低。使用时需根据不同细胞的耐受能力调整强度和时间。Ⅱ消化分散法采用低浓度胰蛋白酶或胶原酶对剪...