第四章质粒载体解析VIP免费

第四章质粒载体•第一节质粒载体概况•第二节质粒DNA的复制与拷贝数的控制•第三节质粒载体的构建•第四节重要的质粒载体•第五节质粒载体的稳定性问题第一节质粒载体的概况•一质粒的定义、命名、分类、分布•二质粒的基本生物学特性•三质粒的分离与纯化一、质粒的定义、命名、分类、分布•定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。•命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后接实验编号，•分类：•分布：1）根据质粒的性状特征①F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。②R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌素抗性基因，Co1质粒：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠杆菌素合成的基因质粒分类•2）根据质粒的传递性•3）根据质粒的拷贝数•4）根据质粒和细菌的关系•4.质粒分布、大小和数目二、质粒的基本特性•1.寄生性•2．质粒DNA构型•3．质粒DNA编码的表型•4．质粒DNA的转移•5．质粒DNA的迁移作用•6．质粒DNA的复制类型•7．质粒的不亲和性•8.其他特性质粒的基本生物学特性•1.寄生性•2．质粒DNA•(图4—1)大肠杆菌质粒分子的结构示意图质粒DNA分子具有三种构型•SC构型:共价闭合环形DNA(cccDNA)，•超螺旋的SC构型；•OC构型:开环DNA(ocDNA)，OC构型；•L构型:发生双链断裂而形成线性分子•(LDNA)，L构型。（图4－2）环形双链DNA质粒分子的三种构型质粒DNA的分子构型质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图(a)(b)OCSCL3.质粒DNA编码的表型•抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，•质粒DNA编码的基因有产生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主控制的限制与修饰系统的基因等4．质粒DNA的转移•(1)接合型质粒的自我传递•(2)F质粒•(3)质粒DNA的接合转移•①细胞交配对的形成•②质粒DNA的转移细菌的接合作用•在合适的条件下，雄性细胞和雌性细胞混合培养，形成雌—雄细胞配对过程为细菌的接合作用(conjugation)。•在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的F因子按滚环复制模式(rollingcirclereplicationmodel)，(1)接合型质粒的自我传递•格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。•接合型的质粒(conjugativeplasmid)，又叫自我转移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。•非接合型的质粒(non—conjugativeplasmid)，不能自我转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。(2)F质粒•又叫F因子(ferti1ityfactor)，单拷贝的接合型质粒，其分子量约为94kb，共编码19个转移基因(tra)。F质粒有三种存在方式：•(i)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不带有染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。•(ii)以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’细胞。•(iii)以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做Hfr细胞(高频重组细胞)。大肠杆菌F因子基因图(3)质粒DNA的接合转移机制•①细胞交配对的形成：大肠杆菌F质粒编码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。•②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。大肠杆菌F质粒转移区结构---该区编码着控制细胞接合作用的基因质粒DNA的接合转移及复制5．质粒DNA的迁移作用•共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。F因子带动Co1E1质粒转移的条件6.质粒的复制类型•两种不同的复制型：•“严紧型”(stringentplasmid)；•“松驰型”(relaxedplasmid)。•质粒拷贝数的定义：•每个细菌细胞中所含有的质粒DNA•分子的数目7．质粒的不亲和性(1)质粒的不亲和性现象(2)质粒不亲和性的分子基础8.质粒的其他特性•稳定性：维持一定的拷贝数•同源性：不同的质粒有相同的同源区•重组性：质粒间、质粒同染色体间重组•消除和恢复性等特性三.质粒DNA的分离与纯化•1．氯化铯密度梯...