PAGE胶电泳、转膜实验技术专辑电泳带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳(electroｐhoｒesis,EＰ)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。193７年瑞典学者A．Ｗ.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白,创建了电泳技术。ﻫPAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响,配胶的比例,在《分子克隆》上有详细的论述。也可选择已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择,打开即用，实验结果更漂亮，分辨率高,特别是重复性好，条带完美。{拜力生物为您准备了所有电泳的试剂，包括上样buffｅｒ，ＳDＳ－ＰAＧＥ配胶试剂盒,电泳buffer、蛋白Marｋer和蛋白染色试剂盒。第一步:根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度进行凝胶的配制,可以使用ＳＤS-ＰAGE凝胶配制试剂盒。第二步:进行蛋白变性，样品先置95℃的水浴加热５分钟,接着置冰浴中5分钟,10０00g离心2０分钟，取上清液（样品可立即使用也可以分装冻存，-２0℃可稳定保持数月)。蛋白上样缓冲液可以使用５×SDS－PAGE蛋白上样缓冲液。第三步依次加入预染蛋白分子量标准和待分析样品。）}基本操作流程:提取细胞或组织蛋白、测定大致含量ﻫ↓制备SＤS-PAＧE胶↓蛋白样品变性、电泳↓ﻫﻫ电泳转膜↓ﻫﻫ封闭（１小时)↓一抗(3小时左右或4度过夜)↓ﻫﻫTBSＴ洗涤（洗三遍)↓HRＰ标记的二抗(1小时)ﻫ↓TBSＴ洗涤(洗四遍)↓ﻫﻫＥCＬ试剂作用↓ﻫﻫＸ-光片曝光、显影↓结果分析详细操作流程ﻫ１．试剂配制与订购ﻫ１.1.SDS-ＰAGE蛋白上样缓冲液ﻫ1．2ＳＤS-PAGE凝胶配制1MTriｓ-HCl（ｐH6.8）：称取24.２３gTris，加ddＨ2O充分溶解,用浓HＣｌ调节pH值至6.8（约14ml),定容至200ml,121oC20miｎ灭菌,室温保存。1ＭTｒｉs-HＣl（pH８.0):称取24.２３gTriｓ,加dｄH２O充分溶解，用浓HCl调节ｐＨ值至8.0（约8．4ml),定容至200ml，12１℃20min灭菌,室温保存。ﻫ1.5ＭＴriｓ-ＨCl（ｐH8.８):称取36．34ｇTris，加dｄH2O充分溶解，用浓HCl调节pＨ值至8.8(约５ml)，定容至２00ｍl,12１℃20min灭菌,室温保存。10％（W/V）SＤS:称取50gＳDS，加4０0mldｄＨ2O，68℃加热溶解。滴加浓HCl调节ｐＨ值至7.2,定容至500ｍl,室温保存。３0%(Ｗ／V)Acrylａｍidｅ：称取２9gAcｒylａmｉde，1gＮ,N’-至甲双丙烯酰胺(BIＳ）,加ddH2O溶解，定容至100ｍl,用0．45ｍ滤膜滤去杂质，4℃避光保存。0．02ＭPＨ７.2PＢS：称取Ｎa2ＨＰO４·12H2O５.8g,ＮaＨ2ＰO4·2H2O0.５9g,NaCｌ8.5ｇ,定溶至10００ｍl蒸馏水中。ﻫ10%（W/Ｖ）过硫酸铵:称取０.1g过硫酸铵,加1mlddH2O充分溶解，４℃保存(有效期约为两周)。1.3ＳDS-PＡＧＥ电泳液5×Tｒis-GｌycｉneＢufｆeｒ(ＳDS－PＡＧE电泳缓冲液):称取15.1gTris，94ｇGlycine，5gSDS，加ddH２O充分溶解,定容至１L,室温保存。ﻫ1×Ｔris－ＧｌycineBuffeｒ(SDＳ－PＡGE电泳缓冲液）:量取200ml5×Tｒｉs-GlyｃineBuffer，定溶至1L,混匀,室温保存。1.4NＣ膜(硝酸纤维素膜)PVDF膜ﻫ1．５Westerｎ转膜液ﻫ称取2.9gＧｌyciｎe，５．8gＴris,0．3７ｇSDS，加ddH２Ｏ充分溶解,定容至８00mｌ，加入２0０ml甲醇，混匀，室温保存。1.6洗涤液20×TBＳ:称取8８gNaCｌ，加ｄdH2O充分溶解，加入100ml1ＭＴｒｉs·ＨCl（pH8.０），定容至50０mｌ,室温保存。TＢSTBuffeｒ：量取50ml20×TＢS，0.5mｌＴween20,加dｄH２Ｏ定容至１L，混匀，室温保存。ﻫ1.７封闭液称取5g脱脂奶粉,加入１00mlTBSTBｕffer中,充分溶解,4ｏC保存。ﻫ1.8一抗,二抗1．9ＥasySeeＷesternBlotＫｉｔ1.10ｍａrkerﻫ１.11BCＡ蛋白定量试剂盒ﻫ２.蛋白样品制备ﻫ2.1蛋白粗提ﻫ在人体中IｇG占总抗体80％，成人血清中含量为12．5%/mｌ左右，IgG粗纯一般用饱和（NH4)2SＯ4(ＳAS）进行，一般操作如下:1）8ml血清中加入8mlＰＢS（0.02PH7.０),混匀后滴加４mlSＡS，使其终浓度为２0%(目的是除去纤维蛋白原)。2）4℃,1h后７000ｒpm离心１0mｉn。3）留上清,补加１２mlＳAＳ，边振荡另滴加。（终浓度为５０%，可除去ＡＩb)ﻫ4）４,℃1h后,7０00rmp离心１０mｉn。ﻫ5）留沉淀...
