十一、伪狂犬病检测方法 伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备 DMEM 培养基、BHK-21 细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22u l微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2 培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录) 2 操作步骤 2 .1 病料的采集 对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球， 4℃送实验室检测。 2 .2 样品处理 待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME 培养基制成1：5 乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm 离心 30分钟后，取上清液经0.22μ m 微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。 2 .3 病料接种 将病料滤液接种已长成单层的BHK-21 细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1 小时后，加入含 10%新生犊牛血清（经过 56℃水浴灭活30 分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM 培养基，置37℃温箱中培养。 2 .4 观察结果 接种后 24—48 小时，BHK-21 细胞应出现典型的细胞病变效应（Cy to pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2 .5 病毒的鉴定 将出现 CPE 的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。 伪狂犬病聚合酶链式反应 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶 K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN 缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中 434—651bp 之间 217bp 基因片段，由上海生物工程公司合成。 序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’， 下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR 扩增仪，电泳仪 2 操作步骤： 2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。 2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按 1:5 用TEN 缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融 3 次，7000r/min 离心 5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心 5分钟，取上清液。取上清液472.5μ l,加入25μ l 10％SDS 和 2.5μ...
