最近我们实验室想做这个试验，以前也没有做过，如果有战友做过这个试验，希望介绍点经验和教训，谢谢乐。 应战友要求，在网上找乐一下基础资料，方便大家查看，虽然下面也列出了试验方法，但在实际实验室可能并不一样，希望战友们较少些自己的亲身体会，让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验流程为： （1）转染后 24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min, 细胞裂解液于 4°C， 最大转速离心 30 min 后取上清； （2）取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1μ g 相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C 缓慢摇晃孵育过夜； （3）取 10μ l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3,000 rpm 离心 3 min； （4）将预处理过的 10μ l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C缓慢摇晃孵育 2-4h，使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在 4°C 以3,000 rpm 速度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1ml 裂解缓冲液洗 3－4 次；最后加入 15μ l 的 2×SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting 或质谱仪分析。 注意的问题： （1）细胞裂解采用温和的...
