免疫组化染色步骤 冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20 秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定 10 分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS 洗，5 分钟×3。 用 3%过氧化氢孵育 5~10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS 洗，5 分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以 SP 试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2 室温孵育 5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2 分钟×3 次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4℃过夜。 5. PBS 冲洗，2 分钟×3 次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释），37℃孵育10~30 分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20 分钟。 7. PBS 冲洗，2 分钟×3 次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释），37℃孵育10~30 分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20 分钟。 9. PBS 冲洗，2 分钟×3 次。 10. 显色剂显色（DAB 或AEC）。 11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。 二步法（以PV-9000 通用型二步法检测试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3% H2O2 室温孵育5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2 分钟×3 次。 4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或 4℃过夜。 5. PBS 冲洗，2 分钟×3 次。 6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或 37℃孵育20 分钟，PBS或 TBS 冲洗，2 分钟×3 次。 7. 滴加试剂2（poly peroxidase...
