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毕赤酵母实验操作手册簿

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毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而,许多蛋白质在翻译后,需经过翻译后的修饰加工,如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制,不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外,蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构,在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠,是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化,但不利于产物的活性,为了得到有活性的蛋白,就需要进行变性溶解及复性等操作,这一过程比较繁琐,同时增加了成本。与大肠杆菌相比,酵母是低等真核生物,具有细胞生长快,易于培养,遗传操作简单等原核生物的特点,又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工,修饰,合理的空间折叠等功能,非常有利于真核基因的表达,能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统,当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的,其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物,不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力,其产物往住形成没有活性的包涵体,需要经过变性、复性等处理,才能应用。近年来,以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视,主更是因为酵母是单细胞真核生物,不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点,还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能,避免了产物活性低,包涵体变性、复性等等间题[1]。与大肠杆菌相比,酵母是单细胞真核生物,具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力,人们对酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)分子遗传学方面的认识最早,酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主.1981 年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因,随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用,但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时,培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失,质粒变得不稳定,拷贝数下降,而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特,因此引起产量下降。同时,实验室用培养基复杂而昂贵,采用工业规模能够接受的培养基时,往往导致产量的下降。为克服酿酒酵母的局限,人们发展了以甲基营养型酵母(methylotrophicyeast)为代...

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